NEUROGÉN GYULLADÁS, VALAMINT SZENZOROS NEUROPEPTID FELSZABADULÁS VIZSGÁLATA A CAPSAICLN- ÉRZÉKENY IDEGVÉGZŐDÉSEKBŐL FIZIOLÓGIÁS ÉS KÓROS ÁLLAPOTOKBAN

EGYETEMI DOKTORI ÍPh.DT ÉRTEKEZÉS

Xx. XXXX XXXXX

PROGRAM ÉS TÉMAVEZETŐ: XX XXXXXXXXXX XXXXX

PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM FARMAKOLÓGIAI ÉS FARMAKOTERÁPIAI INTÉZET

2000.

TARTALOMJEGYZÉK

Általános bevezetés

Az értekezés célkitűzései

idegvégződéseiből felszabaduló endogén szomatosztatin szisztémás gyuiiadasgatlo hatásának vizsgálata patkányban és tengerimalacban 11

B. A szenzoros idegvegződesek antidromos, valamint orthodromos ingerlésével

kiváltott endogén anti-nociceptív hatás vizsgálata 21

II. A capsaicin-érzékeny szenzoros idegvégződések izgatásával kiváltott neuropeptid

III. A. TT-232 szintetikus szomatosztatin analóg gyulladásgátló hatásának vizsgálata 33

B. Endogén neuropeptidek, illetve a TT-232 szomatosztatin analóg hatása

neutrophil leukoeyták akkumulációjára a bőrben 40

IV. SP, CGRP és szomatosztatin felszabadulásának vizsgálata a capsaicin-érzékeny primer afferens neuronok végződéseiből elektromos ingerles, valamint capsaicin

analógok hatására 46

V. Szomatosztatin és CGRP felszabadulásának vizsgálata szisztémás resiniferatoxin kezelés hatására. Nociceptin és anandamid hatása a capsaicin-érzékeny

idegvégződésekből történő neuropeptid felszabadulásra 58

A legfontosabb új eredmények összefoglalása 67

Hivatkozott közlemények jegyzéke 68

Köszönetnyilvánítás 76

Saját közlemények jegyzéke 77

ÁLTALÁNOS BEVEZETES

A CAPSAICIN-FR7.FKFNY PRIMER AFFFRFNSFK JELLEMZÉSE

A klasszikus idegszabályozási elmélet szerint a szenzoros idegrendszer fö feladata a

valósul meg, és az ingerek érzőrostokon át történő továbbítása a központi idegrendszer tele. Ugyanakkor már a múlt században Strieker (1876) felfedezte a gerincvelői hátsó gyökök ingerlesével a bőrben kiváltható vazodilatació jelenséget, amit Xxxxxxx (1901) ‘‘antidrómos vazodilatáció"-nak nevezett el. A klasszikus elkepzeles az axon reflex teórián alapulva az volt, hogy az antidrómos vazodilatációért felelős mediátorok egyes primer afferensek specializálódott efifektor végződéseiből szabadulnak fel. Napjainkra már kísérletesen alátámasztott és általánosan elfogadott tény, hogy egyes szenzoros axonterminálisok kettős:

raktározott neuropeptideket közvetlenül, axonális vezetés nélkül felszabadítani (Xxxxxxxxxx 1984, Xxxxx és Xxxx 1988). A gerincvelői érzőneuronok mai ismereteink szerint heterogén populációt képeznek, vannak tisztán afferens, kevert kettős funkciójú “szenzoros-efferens'’ neuronok, illetve újabban azt is feltételezik, hogy léteznek tisztán lokális effektor funkciót betöltő neuronok is az érződúcokban (Holzer és Maggi, 1998, Holzer 1998). Ez utóbbiak esetében azonban joggal megkérdőjelezhető a szenzoros jelző használata.

Az elsődleges érzőneuronok működésének kutatásában kiemelkedő jelentősége van a capsaicinne k, a paprika (Capsicum annuum) csípőanyagának (8-methyl-N-vanillyl-6- nonenamide), melynek első farmakológiai vizsgálata magyar kutatók munkásságának az eredménye (Hőgyes 1878, Jancsó 1955). A capsaicin szelektíven izgatja az érzőneuronok egy meghatározott populációját, melyre a capsaicin-érzékeny primer afferens neuron (Xxxxxxxxxx 1982) elnevezés napjainkra már általánosan elterjedt. A capsaicin szelektív hatása a polymodális nociceptorokon és a capsaicin farmakológiai receptorának létezése (Xxxxxxxxxx és Xxxxxx-Xxxxx, 1975) biokémiai bizonyítást nyert a capsaicin/vanilloid receptor (VR1) klónozása révén (Caterina és mtsai, 1997). Az elsődleges érzőneuronok 40-50 %-át kitevő capsaicin-érzékeny neuronpopulációba tartoznak exteroceptív területeken a C-polymodális nociceptorok, a meleg és forró receptorok, az AS-polymodális nociceptorok, valamint az interoceptív területeken a nyálkahártyák és viszcerális szervek perivasculáris chemonociceptorai (Szolcsányi 1996b). A capsaicin és származékai ezeken a neuronokon

izgató, nagyobb dózisban alkalmazva deszcnzitizáló, illetve neurotoxikus hatást fejtenek ki.

Ezeknek a nociceptív afferenseknek közös tulajdonságuk, hogy klasszikus afferens funkciójukon kívül lokális effektor (I embeek és Xxxxxx, 1979, Uolzer 1988, Szolcsanyi 1984). illetve szisztémás ncurohumorális (Xxxxxxxxxx 1996b, Xxxxxxxxxx és mtsai, !998a,b) funkciót is betöltenek, vagyis megfelelő inger hatására perifériás idegvégződéseikből tachvkininek (substance P (SP), neurokinin-A (NKA)), calcitonin gén-rokon pepiid fCGRP), és szomatosztatin szabadulnak fel. .Az aktiváció hatására felszabaduló gyulladáskeltő neuropeptidek (SP, CGRP) lokális választ, úgynevezett neurogén gyulladást (Jancsó és mtsai, 1967, Szolcsanyi 1988) váltanak ki az ideg áltál innervált bor es nyaikahartyaterületeken, ami helyi arteriolás és vénás vazodilatacióval, erpermeabilitas fokozódással, plazma protein kiáramlással, majd nyálkahártyák esetén a sejtes elemek (leukoeyták, hízósejtek) aktivációjával jár (Gepetti és Holzer, 1996). Az SP a venulákon vazodilatációt, illetve plazma extravazációt vált ki az NK-1 receptorokon keresztül, a CGRP pedig elsősorban arteriolás vazodilatációt.

a CGRP nem képes plazma extravazációt kiváltani, az SP hatását potencírozza, emellett vazodilatátoros hatásuk is egymást erősíti. Természetesen a lokális keringési hatásokon kívül mindkét peptid változatos, fajtól, valamint szervtől függő motoros, szekretoros, immunológiai, illetve egyéb effektor hatásokat képes kiváltani (Maggi 1995, Lundberg 1996, Xxxxxxxxxx 1996a). így a capsaicin-érzékeny peptiderg érzőidegvégződések egyaránt ellátnak nociceptív afferens és lokális efferens funkciót. Ugyanakkor capsaicin előkezelés után, amely ezen neuropeptidek deplécióját eredményezi az idegvégződésekből, a capsaicin-érzékeny rostokat szelektíven izgató ingerre adott helyi válasz elmarad, a deszenzitizáció eredményeként.

Előzetes vizsgálatok intézetünkben fényt derítettek arra az érdekes jelenségre, hogy exteroceptív területek capsaicin-érzékeny rostjainak antidrómos elektromos, vagy orthodrómos kémiai ingerlésével kiváltott primer neurogén gyulladás szisztémás gyulladásgátló hatása révén gátolja a test távolabbi részén kiváltott szekunder akár neurogén, akár nem neurogén gyulladás kifejlődését (Xxxxxxxxxx 1996b, Xxxxxx és Xxxxxxxxxx, 1988, 1996). Direkt biokémiai, illetve funkcionális módszerekkel sikerült bizonyítani az idegvégződésekből felszabaduló szomatosztatin döntő szerepét a hatás közvetítésében, mivel az endogén gyulladásgátló hatás szomatosztatin antiszérummal, illetve cysteamin előkezeléssel megelőzhető volt, emellett a plazma szomatosztatin szint jelentős emelkedése kísérte (Szolcsányi és mtsai, 1998a,b).

A CAPSAICIN RECEPTORA ES ANALOG VEGYULETEI

A capsaicin által kiváltott csípő, cgő fájdalomérzés a capsaicin-érzekenv szenzoros idegvégződéseken található specifikus receptor aktivációján keresztül jön létre. .A capsaicin VR1 receptor egy ligand aktivált nem-szelektív kationcsatorna, melvet a vamiloid vegvületek mellett fájdalmas hőinger valamint savas pH (magas protonkoncentráció) is kénes aktiválni (Caterina és mtsai, 1997). Lokalizációját tekintve a capsaicin-érzekeny szenzoros neuronok perifériás terminálisán, az axon teljes hosszában, a szómán, valamint a centrális végződésen is megtalálható. Szintézise az idegsejt citoplazmájában történik, ahol a Gulgi-apparátushoz, valamint a plazmamembránhoz kötötten található, majd innen a ligand kötésre alkalmas receptor a centrális, illetve perifériás terminális felé transzportálódik, ahol preterminálisan un.

„small clear vesiculák” formájában, az idegvégződésben pedig membránhoz kötött formában található (Szállási és Blumberg, 1999). Capsaicin kezelés hatására észlelhető ezen „small clear

depléciója.

A kompetitív capsaicin receptor antagonista capsazepin specifikusan blokkolja mind a vanilloidvegyületekkel, mind a hőingerrel kiváltott áramválaszokat, ami a közös hatáshelyre utal (Caterina és mtsai, 1997). Szenzoros idegsejtkultúrán vizsgálva a protonok potencírozzák a capsaicin-kiváltotta válaszokat, magasabb koncentrációban pedig önmagukban képesek membránáramokat kiváltani a capsaicin VR1 receptor aktivációján keresztül (Tominaga és mtsai, 1998). A gyulladásos, valamint ischémiás szöveti károsodások kapcsán kialakuló magas protonkoncentráció fájdalomérzetet vált ki, csökkenti a receptoraktiváció hőküszöbét, illetve potencírozza a capsaicinnel és hőingerrel kiváltott válaszokat (Tominaga és mtsai, 1998). így a capsaicin VR1 receptor egyes fájdalmas kémiai valamint fizikai ingerek integrátoraként működik a nociceptív neuronokon.

Napjainkban már több olyan szintetikus (olvanil, nuvanil, phorbol vanilloidok, terpenoidok, triprenyl phenol vegyületek), illetve a természetben is előforduló analógot (piperin. zingeron, eugenol. guajacol. resiniferatoxin) is ismerünk, melyek a capsaicin receptoron hatnak, de különböznek izgató, illetve deszenzitizaló hatásukban. Ezek közül az Euphorbia resinifera kaktusz vanilloid struktúrát tartalmazó irritáns anyaga, a resiniferatoxin (RTX) a capsaicinhez hasonló hatásokat hoz létre (Szállási és Blumberg, 1989, 1990, Blumberg és mtsai, 1993), azonban különböző tesztekben annál több nagyságrenddel hatásosabbnak bizonyult. Ugyanakkor a hatás különbözőségére utal, hogy ellentétben a

capsaicinnel, az RTX képes a pulmonális chemoreceptorok deszenzitizációját a pulmonális chemoreflex előzetes aktivációja nélkül kiváltani patkányban (Xxxxxxxxxx és mtsai, 1990) Ezeken a kísérleti adatokon alapult az a napjainkban megdőlni látszó feltételezés, miszerint a két vegyület hatása különböző, a capsaicin „C”, míg az RTX hatása „II” típusú receptoraltípusokon érvényesül, azonban valószínűbb az az elképzelés, hogy egyazon receptor

feketebors csípőanyaga szintén izgatja a capsaicin-érzekeny rostokat, és kepes a neuropeptidek felszabadítására a capsaicin-érzékeny idegvégződésekből, illetve kereszt-deszenzitizációt mutat a capsaicinnel, ami a közös hatashelyre utal (Patacchini es mtsai, 1990, Szolcsányi 1983, Xxx es Xxxxx, 1996). Szerkezetileg a capsaicinhez részben hasonló elemet tartalmazó szintetikus vegyület az undecenyl-2-amino-ethanol, amely korábbi a capsaicin-analógokat összehasonlító kísérletekben fájdalomkeltő hatást tekintve a capsaicinnél megközelítőleg három nagyságrenddel bizonyult gyengébbnek (Xxxxxxxxxx és Xxxxxx-Xxxxx, 1975). Ezek az adatok

a vegyület akkor is hatásos ha a hidroxilcsoport alkillánchoz kötődik.

Mind a mai napig nem ismert azonban a receptor endogén ligand vegyülete és nem teljesen tisztázott a szerepe fiziológiás körülmények között. Bizonyított ellenben, hogy szöveti sérüléskor, valamint gyulladásos és ischémiás kóros állapotokban jellemző savas pH érték, valamint az ilyenkor felszabaduló bradikinin, hisztamin és prosztaglandinok szerepet játszanak a capsaicin-érzékeny rostok szenzitizációjában, valamint aktiválásában, mely depolarizációhoz, akciós potenciál generálásához és tovaterjedéséhez vezetve, a fájdalomérzet mellett az effektor funkciónak megfelelően a peptidek perifériás felszabadításán keresztül lokális választ hoz létre (Lundberg 1996). Ezeken az adatokon alapulva a hőinger, valamint a protonok tekinthetők a receptor természetes fizikai, illetve kémiai aktivátorainak. Az anandamiddal, mint endogén cannabinoiddal és capsaicin receptor agonistával kapcsolatos eredményekről a későbbiekben lesz szó.

SZENZOROS NEUROPEPTID FELSZABADULÁS KÓROS ÁLLAPOTOKBAN

A capsaicin-érzékeny idegvégződések jellemző tulajdonsága a nociceptív kémiai ingerekre való érzékenység. Perifériás végződéseinek tartós, endogén ingerlése, pl. krónikus gyulladások esetén, a hátsó gyöki érző ganglionok szenzoros, valamint efferens funkciójának megváltozását hozhatja létre. Kísérletes polyarthritis kiváltása után a n. ischiadicus, hátsó gyöki

xxxxxxxx, hátsó gyök, valamint a gerincvelő SP/CGRP tartalma megnő. Bizonyított ezen kívül, hogy ilyenkor a hátsó gyöki ganglionok idegsejtjeinek SP- és CGRP-szintézise növekszik (preprotachykinin 1- és aCGRP-génexpresszió nő) és ezzel párhuzamosan a gerincvelői peptidfelszabadulás is fokozódik (Donaldson és mtsai 1992), mely utóbbi lészt vehet a kórállapotot kísérő krónikus fájdalom keletkezésében. A neuropeptidek mellett leírták a n.

valamint anti-NGF szérum védő hatását a gyulladáskor létrejövő SP/CGRP szint emelkedésre (Donnerer és mtsai, 1992).

A capsaicin-érzékeny elsődleges érzőrostok fokozott aktivációja, illetve a

következményes perifériás neuropeptid felszabadulás eredményeként kialakuló neurogen gyulladásos komponens számos betegség pathomechanizmusában játszik fontos szerepet. Ezek közé tartozik a légutak esetén az allergiás rhinitis, asthma bronchiale, chronicus bronchitis, az ízületekben a rheumatoid arthritis, a bőrbetegségek közül psoriasis, illetve az agyi ereknél a migraine t,Ferrei es Lám, iw o, cszaiíasi es tíiumoerg, i w j

Ugyanakkor a szisztémás anyagcserebetegsegek közül a diabetes mellitus súlyos szövődménye a perifériás idegek először reverzibilis funkcionális, később irreverzibilis morfológiai károsodása, amely mind a szomatikus mind a vegetatív idegeket érinti. A diabeteses neuropathia pathomechanizmusában a tartósan emelkedett vércukorszintnek kiemelkedő jelentősége van, melynek eredménye a polyol anyagcsereút hiperaktivitása következményes sorbitol felhalmozódással az idegrostokban és a fehérjék nem enzimatikus glikációja. Szerepet játszik a károsodott zsírsavmetabolizmus, az oxidatív stressz, a microangiopathiából eredő endoneurális hypoxia, valamint a trofikus, illetve a növekedési faktorok (NGF) csökkent szintézise is (Fedele és Giugliano, 1997). A károsodás jelei elsőként a legsérülékenyebb myelinhüvely nélküli, valamint vékony myelinhüvelyes szenzoros rostokon jelentkeznek (Fedele és Giugliano, 1997, Ralevic és mtsai, 1993). Kezeletlen kísérletes diabetesben kimutatták a n. ischiadicus, valamint a hátsó gyöki ganglionsejtek SP és CGRP tartalmának csökkenését. Ennek kialakulásában az NGF csökkent mennyiségén kívül a polyol anyagcsereút is szerepet játszik, mivel a neuropeptidek depléciója mind NGF szubsztitúcióval, mind insulin-kezeléssel kivédhető, illetve javítható (Diemel és mtsai, 1992, Xxxxxxx és mtsai, 1998). A neuropeptidek anterográd, valamint retrográd axontranszportja is károsodik az NGF hiány, illetve a polyol anyagcseretermékek felhalmozódása miatt, ami endoneurális ödémát és hypoxiát okozva közvetlenül rontja a neuropeptidek transzportját (Diemel és mtsai, 1992).

A kezeletlen, vagy nem megfelelően kezelt diabetes mellitus viszonylag korai klinikai

jelei a szenzoros zavarok, paraesthéziák, valamint csökkent fájdalomérzés a primer érzőrostok károsodásának, valamint a centrális neuropeptid felszabadulás (SP) érintettségének következtében jönnek létre. Azonban a neuropeptidek szintézisének, illetve transzportjának károsodása a szenzoios zavarokon túl a perifériás efiektoi funkciók iomlásához is vezet.

ANANDAMID - A CANNABINOID ÉS A CAPSAICIN-ÉIiZÉKDNY ÜLNDSZliR KAPCSOLATA

Az endocannabinoidok a marihuana hatóany; hasonló hatásokat képesek létrehozni hatásaikat két i

i D9-tetrahydrocannabinolhoz altípuson, a CB1 es CB2 G-

protein-kapcsok receptorokon kifejtve (DiMarzo és mtsai, 1998). Ezek közül a CB1 receptor elsősorban központi idegrendszeri struktúrákon található, a ionban jelenléte igazolt a perifériás

A CB i receptor jeiemeiei kimuiatiaK. a capsaicm-erzekenv pepuuerg rosuiKon is, uai a kciios jelöléses in situ hibridizációs technikával a CGRP, illetve SP pozitív sejteknek csak 10-13 %-a mutatott jelölődést (Xxxxxxx és Herkenham, 1999). A CB1 receptor aktivációja az adenil- cikláz, valamint a feszültségfüggő Ca“* csatornák gátlásához és inward fC áramok aktiválódásához vezet. Az endogén cannabinoidok mint neuromodulátorok fontos szerepet töltenek be a neurotranszmitterek felszabadulásának, illetve hatásainak befolyásolásán keresztül. A Ca2+ csatornák, illetve az adenil-cikláz gátlása preszinaptikusan a neurotranszmitter felszabadulás gátlásához vezet, míg a K* csatorna aktiváció képes csökkenteni, mintegy kivédeni a depolarizáció és akciós potenciál létrejöttét pre-, valamint post-szinaptikusan hatva (DiMarzo és mtsai, 1998). A cannabinoid és capsaicin-érzékeny rendszer kapcsolata az elmúlt évben került az érdeklődés középpontjába, miután igazolták, hogy [3H]anandamid akkumuláció humán astrocytoma sejtekben capsaicin analóg olvanillal kivédhető (Beltramo és Piomelli, 1999). Az ancmdamid (N-arachidonylethanolamide), mint endogén cannabinoid a CB1 receptor 1992-ben azonosított ligandja (Devane és mtsai. 1992) az egyik legtöbbet vizsgált cannabinoid vegyület. Egyes kísérleti adatok arra utalnak, hogy az anandamid a capsaicin VR1 receptort is képes aktiválni. .Az anandamid a capsaicin-érzékeny afferenseket izgatva izolált artérián CGRP felszabadításán keresztül vazodilatációt hoz létre (Zygmunt és mtsai, 1999), emellett a VR1 receptoron kifejtett agonista hatását patch-clamp kísérletekben is igazolták (Xxxxxxx és mtsai, 1999, Smart és mtsai, 2000). Ugyanakkor ismeretes, hogy az anandamid a capsaicin-érzékeny primer afferenseken lévő CB1 receptoron

gátló hatást fejti ki (Xxxxxxxxxx és mtsai, 1998). Az egymásnak részben ellentmondó eredmények miatt egyenlőre nem tisztázott, tekinthető-e az anandamid a cannabinoid receptor mellett a capsaicin receptor endogén ligandjának is (Xxxxxxxxxx 2nnna,h, 7ygmunt és mstai.

2000 ).

AZ ÉRTEKEZÉS CÉLKITŰZÉSEI

Az értekezésben összefoglalt eredményeim a capsaicin-érzékeny szenzoros neuronok funkciójának felderítéséhez csatlakoznak és a munkacsoport korábbi munkainak folytatását képezik. Elsősorban a szenzoros receptorokból felszabaduló szomatosztatin, valamint az anandamid, mint feltételezett endogén capsaicin receptor ligand szerepét vizsgáltam fiziológiás és pathofiziológiás (diabetes) körülmények között in vivo kísérletekben és in vitro peptidfelszabadulás közvetlen meghatározása revén radioimmunoassay (RIA) módszerekkel.

gyakorolt kvantitatív hatások összehasonlítása alapján.

I. Az első kísérletsorozatban arra kerestünk választ, hogy az exteroceptív területeken már igazolt szomatosztatin közvetítette szisztémás neurohumorális gyulladásgátló válasz kiváltható-e interoceptív területek felől is, a n. vagusok szenzoros rostjainak antidrómos ingerlésével patkányban, valamint egy másik állatfajban, a tengerimalacban. Vizsgáltuk továbbá, hogy a capsaicin-érzékeny idegvégződésekből antidrómos, illetve orthodrómos ingerlés hatására felszabaduló endogén szomatosztatin kivált-e anti-nociceptív hatást is.

II. Streptozotocinnal kiváltott kísérletes diabeteses neuropathiás modellben vizsgáltuk a capsaicin-érzékeny szenzoros rostok ingerlésével kiváltott neuropeptid felszabadulás, neurogén gyulladás, valamint az előbb említett endogén gyulladásgátló jelenség eltéréseit.

III. Az endogén szomatosztatin mint gyulladásgátló mediátor ígéretes lehetőséget rejt magában új típusú gyulladásgátló vegyületek kifejlesztésére. Ennek a kísérletsorozatnak célja az intézetünkben már előzetesen vizsgált heptapeptid szomatosztatin analóg TT-232 hatásának további tanulmányozása volt, különös tekintette! a krónikus gyulladásos folyamatokra, a szenzoros neuropeptid felszabadulásra, illetve a hatásmechanizmus felderítésére. Korábbi vizsgálatok nem tértek ki a gyulladás celluláris fázisára, ezért elemeztem az idegingerléssel felszabadított endogén neuropeptidek, valamint a TT-232 szomatosztatin analóg leukocyta akkumulációra kifejtett hatását.

IV. Tanulmányoztuk a capsaicin, illetve természetben előforduló capsaicin analog vegyületek, mint az RTX és a piperin direkt izgató, illetve akut deszenzitizáló hatását in vitro körülmények között tracheapreparátumból felszabaduló szenzoros neuropeptidek (SP, CGRP. szomatosztatin) Rí A meghatározása alapján.

V. A laboratóriumunkban korábban kifejlesztett specifikus RÍA módszerek segítségével (Németh és mtsai, ! QQ6, 10Q£a) szenzoros neuronentid felszabadulás mérése alapján módszereket dolgoztunk ki capsaicin receptorokon ható agomsta cs moduiáió-antagonista hatások követése céljából. Vizsgáltuk szisztémásán adott RTX, mint capsaicin receptor agonista által kiváltott CGRP, valamint szomatosztatin felszabadulás dózis és időfűggését in vivo a plazma peptid szintek mérésé útján. Az anandamid, mint feltételezett capsaicin receptor agonista hatását a három szenzoros neuropeptid (SP, CGRP, szomatosztatin) felszabadulására gyakorolt in vitro és in vivo hatások alapján elemeztük.

LA. NERVUS VAGUS, ILLETVE NERVUS ISCIUADICUS CAPSAICIN-ERZEKENY SZENZOROS IDEGVÉGZŐDÉSEIBŐL FELSZABADI ILÓ ENDOGÉN SZOMATOSZTATIN SZISZTÉMÁS GYULLADÁSGÁTI Ó HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA PATKÁN YBAN LS TENGE RIMALACBAN

A fejezethez kapcsolódó saját közlemények:

I.A./l. Xxxx M., Xxxxxx J , Xxxxxxxxx Z , Xxxxxx E , Xxxxxx Zs.. Szolcsánvi 1: Anti inflammatory effect of somatostatin released from capsaicin-sensitive vagal and sciatic sensory- fibres of the rat and guinea-pig.

Eur. J. Pharmacol., (közlésre elfogadva) 2000.

I.A./2. Xxxx M., Xxxxxx X., Xxxxxx Zs., Xxxxxxxxx Z., Xxxxxx X., Xxxxxxxxxx J.: Somatostatin mediated systemic anti-inflammatory effect induced by antidromic vagal and sciatic nerve stimulation.

Regül. Peptides, 80, 137, 1999. (előadáskivonat)

I.A./3. Xxxx M., Xxxxxx X., Xxxxxxxxx Z., Xxxxxx G., Xxxxxxxxxx J.: Systemic anti inflammatory effect mediated by somatostatin released from activated sensory vagal nerve terminals in rats and guinea-pigs.

Fundam. Clin. Pharmacol., 13, 328s, 1999. (előadáskivonat) Bevezetés

Előzetes vizsgálataink igazolták, hogy a capsaicin-érzékeny rostok ingerlésével kiváltott primer neurogén gyulladás gátolja a test távolabbi részén kiváltott szekunder akár neurogén, akár nem neurogén gyulladás kifejlődését (Xxxxxxxxxx 1996, Xxxxxx és Xxxxxxxxxx, 1996). Krónikusan denervált területeken kémiai anyagokkal (pl. dextrán, bradykinin) indukált nem neurogén gyulladás nem rendelkezett ilyen szisztémás gyulladáscsökkentő hatással, ugyanakkor alacsony frekvenciájú elektromos ingerles (0.1 Hz) lokális plazma extravazáció kiváltása nélkül is képes volt ezt a hatást létrehozni. Ezek az adatok arra utaltak, hogy a szisztémás gyulladásgátló hatást közvetítő mediátorok közvetlenül az aktivált érzőidegvégződésekből szabadulnak fel és nem a gyulladásos szövetből (Xxxxxxxxxx és mtsai, 1998a). A capsaicin-érzékeny idegrostok végződéseiben a gyulladáskeltő peptidek (SP, NKA, CGRP) mellett kimutatható és ingerléssel felszabadítható neuropeptidek közül gyulladásgátló hatással rendelkeznek az opioid peptidek (Xxxxx 1995), a szomatosztatin (Lembeck és mtsai, 1982) és a galanin (Xx és mtsai, 1991). Az eddigi kísérleti eredmények igazolták az idegvégződésekből felszabaduló szomatosztatin alapvető szerepét a gyulladáscsökkentő hatás közvetítéseben (Pintér és mtsai, 1997, Szolcsányi és mtsai, 1998a,b), azonban teljes biztonsággal nem zárták ki egyéb gátló hatású peptidek részvételét sem.

Mivel a fenti kísérletekben a primer gyulladás kiváltása mindig exteroceptív területeken,

a bőrben történt, felmerült a kérdés, vajon ez az endogén szisztémás gyulladáscsökkentő hatás aktiválható-e viszcerális interoceptorok területén kiváltott p.eurogér. gyulladás során, így a n. vagus tracheát, oesophagust, mediastinális szöveteket ellátó eapsaiein-érzékeny szenzoros rostjainak ingerlésével is. Xxxxxx, hogy a craniáiis és extiaciania'iis szenzoros ganglionok különböznek embriológiai eredetüket, valamint túlélésükhöz és differenciálódásukhoz

aanglionok területén NGF-függö, a vagus ganglionsejtjei BDNF (brain derived neurotrophic

factor) jelenlétét igénylik (Winter 1998).

Bizonyított, hogy a légutakban afferens funkciót mind a spinális afferensek, mind a n. vagus szenzoros rostjai betöltenek (Coleridge es Coleridge, 1984). A trachea SP-, illetve CGRP-immunoreaktív afferens rostjai a n. vagusból származnak, a főbronchusok, valamint az alsó légutak kevert afferens beidegzésében azonban mind a n. vagus, mind a thoracalis spinális afferensek részt vesznek (Xxxxxxxx és mtsai, 1983, McDonald és mtsai, 1988). Ezzel szemben masok adatai szermi patkanyoan a luuo szenzoios oeiuegzese uoiuoen getinoveioi eieúciu (Springall és mtsai, 1987). Ezen ellentmondásos eredmények mellett azonban igazolt, hogy a szenzoros vagus rostok fontos lokális effektor funkcióval is bírnak, mely egyes légúti gyulladásos betegségek (asthma bronchiale) pathomechanizmusában játszik fontos szerepet (Lundberg és mtsai, 1983, McDonald és mtsai, 1988, Xxxxxxxxxx 1996a,b).

Vita tárgyát képezi az is, hogy a capsaicin-érzékenység ezen a területen is a VR1 típusú capsaicin receptor jelenlétéhez kötött-e (Flolzer 1998). In situ hibridizációs kísérletek igazolták a VR1 jelenlétét a n. vagus afferens rostjain, de más receptor altípusok részvételét sem zárták ki (Helliwell és mtsai, 1998, Tominaga és mtsai, 1998).

Kísérleteink célja volt a szomatoszenzoros idegek esetén már leírt szisztémás gyulladásgátló hatás vizsgálata, a szomatosztatin mediátor szerepének elemzése a eapsaiein- érzékeny szenzoros vagus rostok antidrómos elektromos ingerlése kapcsán. Mivel az eddigi kísérletek kivétel nélkül patkányon történtek, a szisztémás neurohumorális eapsaiein-érzékeny gyulladásgátló jelenség vizsgálatát egy másik állatfajon, tengerimalacon is elvégeztem.

Módszerek

1 . Nervus vagus bilaterális antidrómos elektromos mgerlcscvcl kiváltott szisztémás gyulladásgátló hatas vizsgálata patkányon

Kísérleteinket 200-240 g súlyú nőstény Wistar patkányokon végeztük, melyeket

patogénmentes környezetben, 24-25 "C-os hőmérsékleten a PTE állati lázában neveltek. Altatáshoz natrium thiopenthalt (Trapanal, 100 mg/kg, i p ) használtunk A primer neurogén gyulladás kiváltására nyaki feltárásból végzett kétoldali n. vagus átmetszést követően, az idegek perifériás csonkjának antidrómos irányú elektromos ingerlését (20 V, 1 ms, 8 Hz, 20 min) alkalmaztuk. A paraszimpatikus vegetatív hatások kivédésére az ingerlés megkezdése előtt 10 perccel atropin (2 mg/kg, i.v.) előkezelést alkalmaztunk, amely mellett a fenti vagusingerlés nem okozott szignifikáns vérnyomásváltozást.

Vizsgálatainkban a kétoldali vagusingerlés hatását vizsgáltuk egy távolabbi területen, a lábhátakon létrehozott második; neurogen gyulladásra. Mindkét oldali natso végtagot akutan denerváltuk (n. saphenus és n. ischiadicus átvágása 30 perccel a kísérlet előtt) ezzel megakadályozva a nociceptív reflexválaszokat. A másodlagos gyulladást a lábhátak bőrében, paraffinolajban oldott 1 %-os mustárolaj helyi ecsetelésével váltottuk ki, ami a capsaicin- érzékeny C-polymodális nociceptorok orthodrómos irányú szelektív kémiai izgatásával vált ki vazodilatációt és plazma extravazációt (Jancsó és mtsai, 1967). A gyulladás okozta plazma extravazációt Evans kék akkumulációs módszerrel határoztuk meg. .Az állatok a gyulladás kiváltása előtt 10 perccel vénás kanülön keresztül Evans kék festéket kaptak 50 mg/kg dózisban. Mivel ez a festék kötődik a plazma albuminhoz, a gyulladás helyén kilépve az érpályából a gyulladt szövetben történő akkumulációja arányos a plazma extravazáció mértékével. A mustárolajecsetelés után 20 perccel az állatokat elvéreztettük, a lábháti bőröket lemetszettük, majd 72 órás formamid extrakció után 620 nm-en fotométerrel meghatároztuk az extravazálódott festék mennyiségét. Az eredményeket pg/g egységben, nedves szövetsúlyra vonatkoztatva adtuk meg.

A vagusingerlést a lábháti gyuiladaskeitő stimulus alkalmazásával egyidöben. iiietve egy

másik kísérleti csoportban 5 perccel korábban kezdtük. A kontroll csoportban a lábháti neurogén gyulladást megegyező módon váltottuk ki, de a n. vagusokat csak átmetszettük. Egy külön kísérleti csoportban a vagusingerlést 10 perccel megelőzően ganglionblokkoló hexamethonium (5 mg/kg, i.v.) előkezelést alkalmaztunk, azzal a céllal, hogy a n. vagusok paraszimpatikus rostjainak stimulációjára a gyomornyálkahártya, illetve a gastrointestinális

traktus egyéb szomatosztatintartalmu D-sejtjeiból történő esetleges szomatosztatin felszabadulást biztosan kivédjük. A szomatosztatin szerepének vizsgálatára az egyik kísérleti csoportban a gyulladás kiváltása előtt 4 órával cysteamin (280 mg/kg, s.c.) előkezelést alkalmaztunk, amely mint szulfhidril vegyidet a szomatosztatin molekula egy SH-csoportjához kapcsolódva, diszuifidhidat hoz leire, így azt immunológiailag és funkcionálisan szelektíven inaktívvá teszi (Xxxxx és Xxxxxxxxxx, 1985) (csoportonként 6 állatot használtunk, n=6/csoport).

2. Nervus ischiadicus antidrómos elektromos ingerlésével kiváltott szisztémás gyulladásgátló hatás tengerimalacon

Kísérleteinket 350-500 g súlyú tengerimalacokon végeztük, natrium pentobarbital (Nembutal, 30 mg/kg, i.p.) narkózisban. Az ingerlés előtt 1 órával adrenerg neuronblokkoló guanethidin (8 mg/kg, i.p.) előkezelést alkalmaztunk, hogy kiküszöböljük a n. ischiadicusban futó szimpatikus rostok hatasat. Az adatokat pipecuronium bromid (200 jag/kg, i.v.)

n. ischiadicust kipreparáltuk és az átmetszett idegek perifériás csonkjait elektromosan ingereltük (30 V, 0.5 ms, 20 Hz, 20 min), 5 perces időkülönbséggel. Az utolsó gyulladáskeltő stimulus után 15 perccel az állatokat elvéreztettük, a n. ischiadicus innervációjának megfelelő bőrlebenyekben a plazma extravazáció mértékét az Evans kék módszerrel meghatároztuk (n=8).

3. A plazma szomatosztatin koncentrációjának meghatározása patkányban és tengerimalacban bilaterális antidrómos vagusingerlést követően

Az idegingerlésre felszabaduló szomatosztatin mérésére plazma szomatosztatin meghatározást végeztünk 12 órás éheztetési periódust követően. Az artériás vérmintavétel céljából a jobb oldali artéria carotisba kanült helyeztünk be.

1. A kontroll állatokban nyaki feltárásból kétoldali vagusátmetszést végeztünk.

2. Az ingerelt csoportban a vagusok átvágása után 10 perccel a perifériás csonkokat elektromosan ingereltük (20 V, 0 5 ms, 5 Hz, 5 min).

3. A harmadik abdominális vagusátmetszett csoportban a gastrointestinális traktusból történő szomatosztatin felszabadulás kivédésére az ingerlés kezdete előtt 30 perccel hasi feltárásból a

n. vagusok törzsét a rekeszen való átlépés után átmetszettük, a csonkokat 2 %-os Lidocainnal és 96 %-os alkohollal beecseteltük. A nyaki szakaszon kipreparált és átmetszett ideget

megegyező paraméterekkel ingereltük.

4. Az áloperált ingerelt, illetve.

5. az áloperált kontroll csoport adatai arra a kérdésre adtak választ, hogy a műtéti beavatkozás befolyásolja-e az általunk mért szomatosztatin felszabadulást.

6. Patkányokon egv hatodik csoportban szisztémás capsaicin előkezelést végeztünk (1 %-os

capsaicin s e . három napig növekvő 10, 00, Q0 mgAg dózisban), majd a bilaterális nyaki vagusingerlést három nap után a fent leírt módon elvégeztük. Az előkezeléssel azt kívántuk bizonyítani, hogy a szisztémás keringésben mért emelkedett szomatosztatin valóban a n. vagus capsaicin-érzékeny érzőrostjainak terminálisaiból származik (n=ó/'csoport).

Az ingerlés befejezése után 2 perccel artériás kanülön keresztül 3 ml vert nyertünk Trasylolt (1000 IU) és EDTA-t (6 mg) tartalmazó jégben hűtött kémcsövekbe. A 4 °C-on végzett centrifugálást követően a peptidet háromszoros mennyiségű alkohollal extraháltuk. Precipitációt és újabb centrifugálást követően a mintákat nitrogén alatt beparoltuk, majd a

kifejlesztett specifikus RIA módszerrel határoztuk meg (Németh és mtsai, 1996).

4. A plazma szomatosztatin szint változás meghatározása tengerimalacban n. ischiadicus antidrómos ingerlésének hatására

A tengerimalacokat a szomatosztatin szint mérésekor három csoportba osztottuk:

1. A kontroll állatokban az egyik oldali n. ischiadicust átmetszettük.

2. Az ingerelt csoportban az egyik oldalon átvágott ideg perifériás csonkját elektromosan ingereltük (30 V, 0.5 ms, 5 Hz, 5 min).

3. A harmadik csoportba a capsaicin-elökezelt állatok kerültek, ezekben a jobb oldali n. ischiadicus köré 2 %-os capsaicinoldattal átitatott Spongostan szivacsot helyeztünk 30 percig, azután a sebet összevarrtuk. A perineurális előkezelés után 5-6 nappal az idegingerlést elvégeztük. Az ingerlés befejezése után 2 perccel artériás kanülön keresztül 5 ml vért nyertünk az állatoktól, majd a plazma szomatosztatin szinteket RIA módszer segítségével meghatároztuk (n=5-6/csoport)

Az egyes csoportokban az adatok átlagait adtuk meg a standard hibával (átlag±S.E.M.). A plazma extravazációs értékeket nem-parametrikus Mann-Whitney próbával, a plazma szomatosztatin szinteket kétmintás Student t-teszttel elemeztük. Statisztikailag szignifikánsnak P<0.05 esetén értékeltük az adatokat (* P<0.05, ** P<0.01).

Preriménvek

1. An. vagusok perifériás csonkjainak antidromos iranvu elektromos ingerlese (2D V, ! ms, 8 Hz, 2U min), szignifikáns mértekben gátolta a labhatakon kémiai ingerrel kiváltott második plazma extravazációt a kontroll csoport értékeihez viszonyítva. Az cgyidőbcn kezdett ingerles 3ó.45±5.95 %-os (P^ö.öi), míg az 5 perecéi korábban kezdeu stimuláció 50.21 ±4.95

%-os (PO.OÍ) gátlást eredményezett. A hexamethonium előkezelt csoportban szintén 30.39±2.86 %-os (P<0.05) csökkenést észleltünk (I/l.a. ábra). Mivel a hexamethonium előkezelés a gyulladáscsökkentő hatást nem befolyásolta, bizonyítást nyert, hogy a mediátor anyag az aktivált érzőidegvégződésekből szabadult fel.

I/l.a. ábra. Bilaterális vagusingerlés gátló hatása a lábháti neurogén plasma extravazációra

Kontroll Vagus ingerelt

Cysteamin + vagus ingerlés

I/l.b. ábra. Cysteamin előkezelés hatása a bilaterális vagusingerléssel kiváltott gyulladásgátló

A cysteamin előkezelés a gyulladásgátló hatást szignifikáns mléitekben S2.97 %-kal (P<0.01) csökkentette, de azt teljesen kivédeni nem tudta (I/!.b. ábra).

2. Tengerimalacban az egyik oldali n. ischiadicus perifériás csonkjának antidromos irányú elektromos ingerlésével (30 V, 0.5 ms, 20 Hz, 20 min) kiváltott első neurogén gvuüadás

ellenoldalon 5 nerccel később létrehozott második neurogén plazma extravazációt

3. A n. vagusok perifériás csonkjának kétoldali antidromos elektromos ingerlése patkányban a plazma szomatosztatin szint 3.8-szeres (30.5± 1.65 fmol/ml, P<0.01), tengerimalacban 3.3-szeres (26.26±3.16 fmol/ml, P<0.01) emelkedését eredményezte a kontrollokhoz viszonyítva (7.88+1.56 fmol/ml), illetve (7.93±1 88 fmol/ml) A gastrointestinális traktust ellátó idegtörzs átmetszése nem csökkentette szignifikáns mértékben a felszabaduló szomatosztatin mennyiségét, ebben a csoportban patkányban 3.3-szeres (25.73±3.93 fmol/ml, P<0.01), illetve tengerimalacban 2.7-szeres (21,35±1.38 fmol/ml, PO.01) emelkedést tapasztaltunk. Ebből arra következtettünk, hogy a felszabaduló peptid jelentősebb mennyisége a thoracalis érzöidegvégződésekből és nem a gastrointestinális traktusból származik. A műtéti beavatkozás nem növelte szignifikánsan a plazma szomatosztatin szintet: (10.16± 1.51 fmol/ml) patkányban, illetve (10.75+1.49 fmol/ml) tengerimalacban. Az álműtött ingerelt csoportban sem patkányban (36.3±4.18 fmol/ml) sem tengerimalacban (32.27±2.81 fmol/ml) nem tapasztaltunk szignifikáns különbséget a stimulált csoport értékeihez viszonyítva.

Patkányokon a szisztémás capsaicin előkezelés sikeresen kivédte a kétoldali vagusingerlésre bekövetkező plazma szomatosztatin szint emelkedést (10.66± 1.45 fmol/ml), ami bizonyítja, hogy az általunk mért peptidfelszabadulás valóban a capsaicin-érzékeny szenzoros rostok aktivációjának eredménye volt (P+0,01) (1/2.a. és b. ábra).

tin (fmol/ml)

Plazma szomatosztatin (fmol/ml)

1/2.a. ábra. Plazma szomatosztatin szint változások patkányban n. vagus ingerlés hatására

1/2.b. ábra. Plazma szomatosztatin szint változások tengerimalacban n. vagus ingerlés hatására

4. A n. ischiadicus perifériás csonkjának egyoldali aníidrómos elektromos ingerlése a

eredményezte tengerimalacban a kontrolihoz viszonyítva (7.45± 1.58 fmol/ml). Perineurális capsaicin előkezelés a plazma szomatosztatin szint idegingeriés hatására bekövetkező emelkedését kivédte (10.54±1.12 fmol/ml) (1/3 abra)

I/'3. ábra. Plazma szomatosztatin szint változások tengerimalacban n. ischiadicus ingerlés hatására

Következtetések

Kísérleteinkben elsőként sikerült bizonyítani, hogy a n, vagus perifériás csonkjainak elektromos ingerlésével paraszimpatikus blokád jelenlétében a szomatoszenzoros idegek ingerléséhez hasonlóan szisztémás gvulladásgátló hatás jön létre.

Bizonyított, hogy a n. vagus szenzoros rostjai afferens funkciójukon kívül képesek perifériás végződéseikből neuropeptidek felszabadításán keresztül lokális neurogén gyulladásos választ kiváltani, mely vazodilatációt, a venulák területén permeabilitás fokozódást és plazma extravazációt, valamint bronchokonstrikciót hoz létre (Lundberg és mtsai, 1983, XxXxxxxx 1988, Xxxxxxxxxx 1984, 1996a,b). Ezen capsaicin-érzékeny szenzoros rostok ingerlésével

kiváltott lokális primer neurogén gyulladással együtt szisztémás gyulladásgátló hatás is létrejön, amely gátolja a test távoli részén ietrehozott második neurogen gyulladást patkányban

A plazma szomatosztatin szint bilaterális vagusingerlés hatásásra bekövetkező jelentős

növekedése, valamint a cysteamin előkezelés gyulladásgátlásra gyakorolt majdnem teljes blokkolása megerősítik azt a következtetést, hogy a hatást döntően az crzöidegvegzödesekból ingerlés hatására felszabaduló szomatosztatin közvetíti. Nem zárhatjuk ki azonban más gátló neuromediátorok részvételét sem, mivel a cysteamin előkezelés után a n. vagus ingerlésével kiváltott gyulladásgátló hatás 17 %-a megmaradt, ugyanakkor előzetes kísérleteinkben a n. ischiadicus antidrómos ingerlésével kiváltott plazma szomatosztatin szint emelkedés, illetve gyulladásgátló hatás megegyező dózisú cysteamin előkezeléssel teljesen kivédhető volt. Ezek az eredmények összhangban állnak azon immunohisztokémiai adatokkal, melyek igazolták, hogy míg a bőrt beidegző hátsó gyöki ganglionsejtek körülbelül 20 %-a mutat szomatosztatin immunoreaktivitást (Xxxxxx 1996), addig ez az arány a ganglion nodosum, petrosum és jugulare területén jóval kisebb (Helke és Hill, 1988). Mindezek ismeretében nehezen volt magyarázható a n. vagusok érzőrostjainak antidrómos ingerlésével kiváltott igen jelentős (közel négyszeres) plazma szomatosztatin szint emelkedés. A capsaicin-előkezelés és vagus átmetszéses kísérlet eredményei azonban egyértelműen igazolják a felszabaduló szomatosztatin szenzoros eredetét és kizárják a gastrointestinális traktusból felszabaduló szomatosztatin részvételét.

A tengerimalacokon végzett kísérletek eredményeivel sikerült igazolnunk a patkányban már leírt endogén szisztémás neurogén gyulladásgátló jelenséget egy másik állatfajban is. A plazmaszint mérések eredményei ebben a fajban is megerősítették a capsaicin-érzékeny érzőidegvégződésekből inger hatására felszabaduló idegi eredetű szomatosztatin mediátor szerepét. Az aktivált szenzoros idegvégződések tehát klasszikus afferens, illetve lokális efferens funkciójukon kívül egy új típusú neurohormonális választ is kiváltanak az interoceptorokból és exteroceptorokból felszabaduló és a keringésbe jutó szomatosztatin szisztémás hatása révén.

I.B. A SZENZOROS [DEGVEGZODESEK ANTIDROMOS, VALAMINT

ORTHODRÓMOS INGERLÉSÉVEL KIVÁLTOTT ENDOGÉN ANTI-NOCICEPTIV HATÁS VIZSGÁLATA

A fejezethez kapcsolódó közlemény:

I.B./l. Helyes Zs., Than M., Xxxxxx G., Xxxxxx E., Xxxxxx J , Xxxx Xx , Xxxxx.sányi I • Anti nociceptive effect induced by somatostatin released from sensory nerve terminals and by synthetic somatostatin analogs in the rat

Neurosci. Lett., 278, 185-188, 2000. Bevezetés

Bizonyított, hogy a capsaicin-, hő-, valamint egyéb gyulladásos mediátorokra érzékeny nociceptorok aktiválása a helyi fájdalomérzeten kívül neuropeptidek felszabadulásához vezet (Maggi 1995, Szállási és Xxxxxxxx, 1999). Ezek közül a CGRP, valamint az SP elsősorban a helyi neurogén gyulladásos válaszban játszik szerepet. Az előző fejezet, valamint korábbi kísérletek adatai (Xxxxxxxxxx és mtsai, 1998a,b) igazolták, hogy a capsaicin-érzékeny primer afferensek idegvégződéseiben tárolódó szomatosztatin inger hatására elegendő mennyiségben szabadul fel ahhoz, hogy szisztémás gyulladásgátló hatást váltson ki. Ismeretes emellett, hogy az exogén szomatosztatin gyulladásgátló (Lembeck és mtsai, 1982, Karalis és mtsai, 1994) hatásán kívül anti-nociceptív hatást is létrehoz (Chrubasik 1991).

Ezen eredmények ismeretében érdekesnek látszott megvizsgálni, hogy a capsaicin- érzékeny idegvégződések antidrómos és orthodrómos ingerlése a gyulladásgátláson kívül kivált-e anti-nociceptív hatást is. Kísérleteinkben az anti-nociceptív hatást chemonociceptív ingerrel kiváltott cardiorespirátoros reflexeken vizsgáltuk.

Módszerek

A kísérleteket 1 g/kg, i.p. urethannal altatott nőstény Wistar patkányokon végeztük, mely narkózis alkalmas chemonociceptív vegetatív reflexválaszok tesztelésére. Chemonociceptív inger (capsaicin) hatására urethan narkózisban szisztémás vérnyomásemelkedés (presszor válasz), szívfrekvencianövekedés és légzésszámfokozódás jön létre. A bal juguláris vénát és a jobb oldali artéria carotist megkanüláltuk a vénás anyagadás, illetve capsaicin injektálás céljából. T-tracheatubust alkalmaztunk a mesterséges lélegzetés (első csoport), illetve a légzésfrekvencia regisztrálása céljából, A vérnyomás, valamint

szívfrekvencia változásait a bal oldali artéria carotisba helyezett kanülön keresztül,

számítógéphez kapcsolt poligráf segítségével folyamatosan monitoroztuk.

1. Antidrómos idegingerléssel kiváltott endogén anti-nociceptív hatás vizsgálata

Az első kísérleti csoportban n. ischiadicus antidromos elektromos ingeriesenek (20 V, 0,5 ms, 5 Hz. 5 min) hatását vizsgáltuk intraarteriális capsaicin-kiváltotta nociceptív reflexválaszra. Az állatokat a kísérlet előtt 1 órával guanethidinnel (8 mg/kg, i.p.) előkezeltük, pipecuronium bromiddal (200 pg/kg, i.v.) reiaxáltuk és mesterségesen lélegeztettük. Az ismételt capsaicin (1 pg/kg, i.a.) adások hatására bekövetkező vérnyomásválaszokat regisztráltuk (MAP) az ingerles előtt, illetve 10, 20, 30, 40, 50, őO perccel a n. isciadicus ingerlése után. A változásokat az idegingerlés előtti capsaicin injekcióra adott vérnyomásemelkedéshez viszonyítottuk (n=5).

A második csoportban orthodrómos kémiai ingerlés hatását vizsgáltuk hasonlóan intraarteriálisan adott capsaicinnel (1 pg/kg) kiváltott reflexválaszokra. Mindkét hátsó végtagot akutan denerváltuk (n. saphenust és n. ischiadicust 30 perccel a kísérlet előtt átvágtuk) ezzel megakadályozva a nociceptív reflexválaszokat. A lábhátak bőrét paraffmolajban oldott 1 %-os mustárolajjal ecseteltük, ami a capsaicin-érzékeny nociceptorokat orthodrómosan izgatja, míg a kontroll csoportban a solvenst (paraffinolajat) alkalmaztuk. A vérnyomás, szívfrekvencia, illetve légzésfrekvencia változásait regisztráltuk a paraffin-, illetve mustárolajecsetelés előtt és 5, 10, 15 perccel utána az ismételt capsaicin adások hatására (n= 10).

3. Plazma szomatosztatin szint meghatározás

Intraarteriális (1 pg/kg) capsaicin adás után 5 perccel, az ellenoldali artéria carotis kanülből vett arteriális vérből mértük a plazma szomatosztatin szint változását RIA-val annak kizárására, hogy az esetlegesen így felszabadított szomatosztatin hatására a reflexválaszok önmagukban csökkennének (n=4).

Statisztikai értékelésre nem-parametrikus Mann-Whitney (páratlan adatok), illetve Wilcoxon (páros adatok) teszteket használtunk. Statisztikailag szignifikánsnak P<0.05 esetén értékeltük az adatokat (* P<0.05, ** P<0.01).

Eredmények

1. Kontroll esetben 1 pg/kg, i.a. capsaicin a vérnyomás reprodukálható emelkedését váltotta ki. Az átlagos artériás középnyomás (MAP) 47.7±3.5 %-ka! nőtt (74.5±5.7 Hgmm-ről 110.1±10.6 Hgmm-re). Nem tapasztaltunk szignifikáns csökkenést a válaszokban, amennvihen kontroll esetben 8-10 alkalommal megismételtük a capsaicin adásat. Bilaterális n. ischiadicus ingerlés a capsaicin-kiváltotta reflexes vérnyomásemelkedést 49.78±U.92 %-kal gátolta az ingerlés kezdete után 10 perccel (P<0.01 Wilcoxon teszttel az ingerlés előtti kontroll válaszhoz viszonyítva). A válasz egy órán belül fokozatosan visszatért (174. abra).

'S 50

t 40 -

d 30 “

< 20 -

k k k k “ “

1/4. ábra. N. ischiadicus antidrómos ingerlésének gátló hatása capsaicinnel (1 pg/kg, i.a.) kiváltott reflexes vérnyomásemelkedésre.

2. A bőr nociceptorainak orthodrómos kémiai ingerlése szintén gátló hatást fejtett ki a capsaicinnel kiváltott nociceptív cardiorespiratorikus reflexválaszokra. Ebben a csoportban

kontroll esetben 1 pg/kg, i.a. capsaicin hatására a MAP 42.41±6.9 %-kal nőtt (70.9±6.5 Hgmm-ről 100.9+11.58 Hgmm-re), a szívfrekvencia 14.9+1.9 %-kal (286+29/min-ról 329±34/min-rc), a légzcsszám pedig 33.7+2.9 %-kal (85+9/miii-rői 114+15/min-re) növekedett. Ezek a válaszok szignifikáns mértékben csökkentek mustárolajecsetelés után 5, 10,

15 perccel, a kontroll csoportban azonban nem változtak (* P<0.05, ** P<0.01, Wilcoxon

teszttel, a mustárolajkenés előtti kontroll válaszhoz viszonyítva, # P<0.05, ## P<0.01, Mann- Whitney teszttel a paraffin olajjal kezelt kontroll csoport énékeihez viszonyítva) (1/5. abra).

1 ---- 1 Paraffin olaj

60 "1 mam 1 %-os mustárolaj

1/5. abra. Lábhati bor nociceptorainak orthodrómos ingerlésével (1 %-os mustárolajecseteles) kiváltott gátló hatás capsaicinre (1 jag/kg, i.a.) adott cardiorespiratórikus reflexválaszokra, (artériás középnyomás (mean arterial pressure: MAP); szívfrekvencia (heart rate: HR); légzési frekvencia (respiratory rate :RR))

3. Intraarteriálisan adott 1 pg/kg capsaicin nem okozott szignifikáns plazma szomatosztatin szint emelkedést az oldószerrel kezelt kontrolihoz viszonyítva 5 perccel az adás

után (7.0±0.54 fmol/ml, illetve Ó.QrO.OS finoí/mi). Capsaicin tehat ebben a ki* dózisban alkalmazva mint nociceptív inger szerepel, de önmagában nem befolyásolja a plazma szomatosztatin szintet.

Eredményeink igazolják, hogy a szenzoi

orthodrómos kémiai ingerlése gátló hatást fejt ki a capsaicinnel, mint chemonociceptív i kiváltott nociceptiv cardiorespiratórikus reflexválaszokra.

Az alkalmazott antidrómos n. ischiadicus előzetes kiserieteKDen a piazma szomatosztatin szint

mely jelentős (50 %) gyulladásgatló hatást eredményezett (Xxxxxxxxxx és xxxxx, 1998a). A bőr capsaicin-érzékeny idegvégződéseinek 1 %-os mustárolajjal kiváltott szelektív orthodrómos ingerlése szintén gyulladásgátló hatást és plazma szomatosztatin szint emelkedést hozott létre (Xxxxxxxxxx és mtsai, 1998b) és az intraperitoneálisan adott szomatosztatin gátló hatást fejtett ki a helyileg alkalmazott capsaicinnel vagy mustárolajjal kiváltott nociceptív reflexválaszokra.

Mivel az ingerlések előtt a központi idegrendszerhez befutó afferens pályákat megszakítottuk, az aktivált helyek felől kiváltott reflexek, illetve a központi idegrendszer részvétele (“diffuse noxious inhibitory control”) kizárható (Villanueva és mtsai, 1986). Ezek alapján arra következtettünk, hogy az anti-nociceptív hatást az aktivált perifériás szenzoros idősekből felszabaduló endogén peptidmediátor közvetíti. Feltételezésünk szerint

oszatin a felelős, de ennek bizonyítására további kísérletek szükségesek.

A natív szomatosztatin terápiás a

és rövid plazma féléletidejc. Endokrin hatással nem rendelkező, szelektíven az ssí4 szomatosztatin receptoron ható analógok vizsgálatáról, mely jelenleg is folyik intézetünkben, a

III. fejezetben még lesz szó.

II A CAPSAICrN-ÉRZÉKENY SZENZOROS IDEGVEGZŐDESEK IZGATÁSÁVAL

KIVÁLTOTT n e u r o p e p t i d FELSZABADULAS, i l l e t v e g y u l l a d a s g a t l o

h a t á s k á r o s o d á s a k í s é r l e t e s d i a b e t e s m e l l i t u s b a n

A fejezethez kapcsolódó saját közlemények:

n /1 . Xxxxxx X., Xxxxxxxxx Z., Xxxx M., Xxxxxx G., Xxxx R., Xxxxxxxxxx J.: Decreased sensor

neuropeptide release from trachea of the rat with streptozotocin-induccd diabetes. Eur. J. Pharmacol., 369, 221-224, 1999.

II./2. Xxxxxx X., Xxxx M., Xxxx R., Xxxxx X.. Xxxxxx X., Xxxxxx B., Xxxxxxxxxx X., Xxxxxxxxx Z.:

Impairment of neurogenic inflammatory and anti-inflammatory responses in diabetic rats. Eur. J. Pharmacol., 386, 83-88, 1999.

II./3. Xxxxxx J., Xxxx M., Xxxxx B., Xxxxxx G., Xxxxxxxxxx X., Xxxxxxxxx Z.: Impaired anti inflammatory response and decreased sensory neuropeptide release in streptozotocin-induced diabetes.

J. Physiol. London, (közlésre elfogadva) 2000. (előadáskivonat)

Bevezetés

A szenzoros íaegeK funkciójában Dekovetkezo károsodás aitaianosan eiotorauio jelenség a perifériás neuropáthiában szenvedő betegek esetében, ami a diabetes mellitus legsúlyosabb szövődményeinek egyike (Xxxxxx és Giugliano, 1997, Ralevic és mtsai, 1993, Xxxxxxx és mtsai, 1998). Új aspektusa a szenzoros neuropathiának az a korábban már bizonyított tény, hogy a capsaicin-érzékeny érzőrostok a szenzoros információk felvétele, valamint azok központi idegrendszer felé való továbbítása mellett biológiailag aktív mediátorok, neuropeptidek felszabadításán keresztül fontos lokális szabályozó funkciót is ellátnak. így károsodásuk nemcsak szenzoros fúnkciócsökkenéshez vezet, hanem befolyásolja a gyulladásos, sebgyógyulási, vascularis proliferatív folyamatokban szerepet játszó szenzoros- effektor funkciót is (Brain 1996, Xxxxxxxx 1996, Xxxxxxxxxx 1996).

Kísérletes insulin-hiányos diabetes mellitusban jellegzetes tünet a szenzoros neuropeptidek (CGRP, SP) insulin-szenzitív depléciója (Diemel és mtsai, 1992), valamint a neurogén gyulladásos válasz csökkenése. Ez utóbbit azonban egyes szerzők (Xxxxx és Xxxxxx, 1985) a neuropeptidek depléciójával szemben azok csökkent hatásával magyarázzák és microvasculáris eredetűnek tartják. Sokkal valószínűbb és kísérletesen több oldalró' megerősített ezzel szemben az az elmélet, hogy a pro-inflammátoros szenzoros neuropeptidek felszabadulásának csökkenése áll a hátterében a kísérletes diabetesben szenvedő laboratóriumi állatok, valamint a diabetes mellitusban szenvedő betegek esetében észlelhető csökkent neurogén gyulladásos válasznak (Győrfí és mtsai, 1996, Xxxxxxxx és Xxxxx, 1991). Ez a

károsodás részben visszavezethető a trofikus faktorok elsősorban NGF hianvara, továbbá a hyperglikémia következtében kialakuló endoneurális károsodásokra, mivel NGF-, illetve insulin-kezeléssel a neurogén microvasculáris válaszban jelentős javulás érhető el (Diemel és mtsai, 1992, Bennett és mtsai. 1998).

Tudomásunk szerint eddig nem történtek vizsgálatok a bzomatu^ztatin, CGRP. valamint SP szimultán felszabadulásának érintettségére streptozotocin-kiváltotta diabetes mellhúsban, ezért kísérleteink in vitro része elsősorban erre irányúit. Mivel voltak adatok a primér neurogén gyulladásos folyamatok károsodására, megvizsgáltuk a capsaicin-érzékeny szenzoros idegvégződésekből felszabaduló szomatosztatin által közvetített szisztémás gvulladásgátló hatás érintettségét is in vivo körülmények között.

Módszerek

csoportba osztva: 1. kontroll, 2. i.v. 50 mg/kg streptozotocinnal kezelt, 4 hetes diabeteses csoport, 3. i.v. 50 mg/kg streptozotocinnal kezelt, 8 hetes diabeteses csoport. In vitro peptidfelszabadítási kísérletek az 1. és 2. csoportokban, in vivo kísérletek mindhárom csoportban történtek.

1. Neuropeptidek in vitro felszabadulásának vizsgálata tracheapreparátumon

A natrium pentobarbitallal (Nembutal, 40 mg/kg, i.p.) narkotizált patkányok tracheáit kimetszettük és szervfürdőnként (1.8 ml) 2-2 szervet 37 °C-os oxigenizált (95 % CF és 5 % CO2) Krebs oldattal 60 percen át perfundáltuk (1 ml/perc). Az átáramlás leállítása után a kamrákban lévő oldatot 8 percenként 3-szor lecserélve frakciókat gyűjtöttünk (ingerlés előtti - ingerelt - ingerlés utáni). A peptidfelszabadulást elektromos téringerléssel (40 V, 0 1 ms, 10 Hz, 120 s) váltottuk ki. A mintákat jégbe hűtött csövekbe gyűjtöttük és a kísérlet végén a légcsődarabok nedves súlyát lemértük. A frakciók SP, CGRP és szomatosztatin koncentrációit intézetünkben kifejlesztett specifikus RIA módszerek segítségével határoztuk meg (Németh és mtsai, 1996, 1998a, 1999), melyek érzékenysége a CGRP eseteben 1 fmol/cső, a szomatosztatin és az SP-mérésnél 2 fmol/cső. A peptidek mennyiségét fmol/mg egységben, nedves szövetsúlyra vonatkoztatva fejeztük ki (n=6/csoport).

2 Neurogén gyulladás valamint gyulladásgátló hatás vizsgálata in vivo

A kísérletet nátrium thiopenthailal (Trapanal, 100 mg/kg, i.p.) altatott patkányokon végeztük. A guanethidin (8 mg/kg, i.p.) előkezelés után az állatokat pipecuronium bromiddal (200 pg/kg, i.v.) relaxáltuk és a kísérlet alatt tracheakanülön keresztül mesterségesen lélegeztettük. Mindkét oldali n. íschiadicust kipreparaltuk és az átmetszett idegek peritériás csonkjait elektromosan ingereltük (20 V, 0 5 ms, 5 Hz, 5 min) 5 perces időkülönbséggd a két oldal között. Az utolsó gyulladáskeltő stimulus után 15 perccel az állatokat elvéreztettük, a n. ischiadicus innervációjának megfelelő bőrlebenyeket lemetszettük, majd a plazma extravazáció mértékét az Evans kék akkumulációs módszerrel meghatároztuk (n=5-6).

3. Diabetes mellitus hatása a bilaterális antidrómos n. ischiadicus ingerléssel kiváltott plazma szomatosztatin szint változásra

A plazma szomatosztatin szint meghatározásához 12 órás éheztetés után 3 ml artériás

EDTA-t (6 mg) tartalmazó jégben hűtött kémcsövekbe. A kontroll állatokban az alap szomatosztatin szinteket mértük, a n. ischiadicusokat csak átmetszettük. A stimulált csoportban mindkétoldali n. ischiadicus perifériás csonkját antidrómosan ingereltük (20 V, 0.5 ms, 5 Hz, 5 min). A vérmintákat az ingerlés befejezése után 2 perccel vettük le az állatoktól, majd a plazma szomatosztatin szinteket RIA módszer segítségével meghatároztuk (n=6).

Mindezek mellett plazma insulin (RIA), illetve vércukormeghatározás (glucose oxidase- peroxidase módszerrel) is történt, valamint követtük az állatok súlygyarapodását mind a kontroll, mind a diabeteses csoportokban. A perifériás idegek érintettségének igazolására méréseket végeztünk az A- és C-rostok vezetési sebességének meghatározásával.

A plazma extravazációs értékeket nem-parametrikus Mann-Whitney próbával, a plazma szomatosztatin szinteket kétmintás Student t-teszttel elemeztük. Statisztikailag szignifikánsnak P<0.05 esetén értékeltük az adatokat (* P<0.05, ** P<0.01).

Eredmények

1. Az egészséges állatokból származó tracheapreparátumokból az elektromos téringerlés szignifikáns mértékű felszabadulást eredményezett a második frakcióban mindhárom peptid esetében. Szomatosztatin esetén 0 .18±0.03-ról 0.5 l±0.03-re, CGRP-nél 0 .17±0.03-ről 0.69±0.12-re, SP-nél 1.77+0.09-ről 5.96+0.38-ra, fmol/mg nőtt az ingerelt frakció

peptidtartalma (P<U.U1). Diabeteses állatokban ez a valasz szignifikáns mértekben (P<0 01) csökkent (szomatosztatin 0.31±0.09, CGRP 0.41 ±0.14, SP 3.14±0.44 fmol/mg). A gátlás 39 2±2.8, 40.5±3.2 és 47.3±2.9 %-ot ért el szomatosztatin, CGRP, illetve SP esetében. Eredményeink tehát igazolták a három vizsgált peptid (szomatosztatin, CGRP és SP) felszabadulásának parallel károsodását (II/'l. abra).

II/1. ábra. Szenzoros neuropeptid felszabadulás károsodása kísérletes diabetes mellhúsban

2. Egészséges állatokhoz kepest a primer plazma extravazációs értékek mindkét diabeteses csoportban szignifikáns mértékben csökkentek. A 4 hetes csoportban 51.27 %-os (P<0.01), a 8 hetesben 44.25 %-os (P<0.05) csökkenést tapasztaltunk. Míg normál állatokban

a n. ischiadicus antidrómos elektromos ingerlésével kiváltott primer neurogén gyulladás 52.7±3.1 %-kai (P<0.01) gátolta az 5 perccel később az eilenoídaion hasonio módón kiváltott másodlagos plazma extravazációt, ez a gátló hatás diabeteses állatokban nem ért el szignifikáns mértéket: a 4 heteseknei 29.611.98 %-ra, a 8 hetes csoportban 18.12+1.57 %-ra csökkent (II/2. ábra).

II/2. ábra. Neurogén gyulladás és általa kiváltott endogén gyulladásgátló hatás károsodása kísérletes diabetes mellhúsban

3. Az éhgyomri plazma szomatosztatin szintek mindkét diabeteses csoportban megemelkedtek. A 4 hetes csoportban 83.64 %-os (P<0.01), a 8 hetesben 163.5 %-os (P<0.05) igen határozott emelkedés volt észlelhető, a normál kontrollokhoz viszonyítva. Ugyankkor míg az egészséges állatokban a bilaterális n. ischiadicus ingerlés több mint négyszeres szomatosztatin szint emelkedést eredményezett (6 36+0 30-ról 28 30+2 60-ra,

fmol/ml, P<0.01), diabeteses állatokban ez a válasz lecsökkent (11,68±1.37-ről 17.90±3.74-re, fmol/ml a 4 hetesekben, valamint 16.7613.85-ról 25.0611,67-ra, fmol/ml a 8 hetes diabeteses csoportban) és nem ért el szignifikáns mértéket (II/3. ábra).

ÍI/3. ábra. Bazális plazma szomatosztatin szintek, valamint n. ischiadicus ingerlés hatására bekövetkező változások egészséges, illetve diabeteses patkányban.

4 Míg a kontroll állatokban a 4 hetes periódus alatt 42±3.3 g súlygyarapodás volt észlelhető, mindkét diabeteses csoportban fogyást tapasztaltunk. Az éhgyomri vércukorszintek a következőképpen alakultak: 6.0±0.3 (kontroll), 23.6±3.1 (4 hetes; P<0.01), és 18.4±3.2 mmol/1 (8 hetes; P<0.01). A plazma insulin koncentrációk szignifikáns mértékben lecsökkentek 10.5±2.7-ről (kontroll) 2.5±0.6-re (4 hetes; P<0.05), illetve 2.8±0.9-ra, p.IU/ml (8 hetes; P<0.05). Az ingerületvezetési sebesség mérések (A-rostnál 0.5 V, 5 Hz, C-rostnál 3 V, 5 Hz) mindkét rostpopulációban a vezetési sebesség szignifikáns csökkenését igazolták, mely a diabeteses állapot fennállási idejével párhuzamosan romlott.

Következtetések

Tracheapreparátumon végzett in vitro neuropeptid felszabadításos kísérleteink igazolták a három vizsgált peptid, a szomatosztatin. CGRP és SP felszabadulásának parallel károsodását diabetes mellhúsban. In vivo eredményeink alátámasztották az előzőekben már leírt bazális plazma szomatosztatin szint emelkedést (Fischer és mtsai, 1998), valamint a neurogén gyulladásos válasz csökkenését insulin-hiányos kísérletes diabetes mellhúsban (Gamse és Jancsó, 1985, Győrfi és mtsai, 1996).

Streptozotocinnal kiváltott kísérletes diabetesben a primer neurogén plazma extravazáció csökkenése, a jelen vizsgálatok alapján egyértelműén az említett gyulladáskeltő neuropeptidek (SP, CGRP) csökkent felszabadulásával magyarázható. A diabeteses perifériás

neuropathiát kísérő neuropeptid deplécióra, illetve károsodott axontranszportra is vannak mar adatok (Fedele és Giugliano, 1997, Xxxxxxx 1998), bár a depléció tekintetében az eredmények ellentmondóak (Gamse és Jancsó, 1985). Figyelembe kell venni azt a tényt is, hogy önmagában a neuropeptidek depléciója nem bizonyíték a funkcionális károsodás mellett

A fenti eredményeken kívüi elsőkent vizsgáltuk a kiserietes diabetes itatását a szenzoros idegvégződésekből felszabaduló szomatosztatinra és az általa kiváltott gyulladásgatio funkcionális hatasra. Igazoltuk az egészséges állatokban leírt endogén gyulladásgátló válasz kiesését diabeteses patkányban, amelynek hátterében a hatást közvetítő idegi eredetű szomatosztatin felszabadulásának csökkenése áll. Mindezen adatok alapján a plazma szomatosztatin szint emelkedése felfogható egy kompenzatórikus változásként, az aktivációra csökkent mennyiségben felszabadítható idegi eredetű szomatosztatin pótlására. Az SP, illetve a CGRP depléciója és károsodott felszabadulása mellett az állandóan emelkedett bazalis plazma szomatosztatin szint ugyanakkor járulékos faktorként szerepet játszhat az

HI A. TT-232 SZINTETIKUS SZOMATOSZTATIN ANALOG GYULLADASGATLO HATÁSÁNAK VIZSGÁLATA

A fejezethez kapcsolódó saját közlemények:

III.A./l. Xxxxxxxxxx X., Xxxxxx X., Xxxxxx Zs., Xxxxxx J , Xxxxxx G., T'hán M., Xxxx Gy.: Anti inflammatory effect induced by TT-232, a novel heptapeptide somatostatin analog.

Regül. Peptides, 80, 137, 1999 (előadáskivonat)

III.A/2. Xxxxxx E., Xxxxxx Zs., Xxxxxx J., Xxxxxx G , Than M.. Kéri Gy . Xxxxxxxxxx J : Pharmacological analysis of the anti-inflammatory effect induced by TT-232, a novel heptapeptide somatostatin analog.

Fundam. Clin. Pharmacol., 13, 36s, 1999. (előadáskivonat)

III.A./3. Xxxxxx, Zs., Xxxx, M., Xxxxxx, X., Xxxxxx, X., Xxxxxx, X., Xxxx, Gy., Xxxxxxxxxx, X.: Mechanism of the inhibitory effect induced by TT-232 and anandamide on sensory neuropeptide release

Neurobiology, (közlésre elfogadva) 2000. (előadáskivonat)

Bevezetés

gastrointestinális traktusban és a belső elválasztást! szervekben 14 és 28 aminosavból álló formában előforduló pepiid, mely változatos endokrin hatásain túl gátolja a tumorsejtek osztódását, befolyásolja a kognitív és viselkedési folyamatokat, valamint a cardiovascularis rendszert. Hatásai 5 receptor altípuson keresztül valósulnak meg (sstl-5), amelyek a G- proteinhez kapcsolódó receptorcsalád tagjai (Xxxxxxx és xxxxx, 1990, Xxxxx és xxxxx, 1990, Reisine 1995). A natív szomatosztatin terápiás alkalmazhatóságát jelentősen korlátozza széles hatásspektruma és rövid felezési ideje, azonban szelektíven ható, hosszú hatású analógok új terápiás lehetőségeket kínálnának. Az utóbbi években szintetizált új szomatosztatin analógokkal végzett vizsgálatok elsősorban endokrin és antitumor hatású molekulák előállítására irányultak.

Az irodalomból ismeretes az exogén szomatosztatin neurogén gyulladást és nocicepciót gátló hatása (Xxxxxxx és mtsai, 1982, Karalis és mtsai, 1994). Az előző kísérleti eredményeink igazolták, hogy e peptid felszabadul az aktivált capsaicin-érzékeny szenzoros idegvégződésekből és a keringésbe jutva szisztémás gyulladásgátló és fájdalomcsillapító hatással rendelkezik. Laboratóriumunkban mar folytak előzetes vizsgálatok a szomatosztatin, octreotide, valamint 3 új, a Magyar Tudományos Akadémia, Központi Kémiai Kutató Intézetében Xxxx Xxxxxx és mtsai által szintetizált, stabil, ciklikus analóg vegyúlet gyulladásgátló és anti-nociceptív hatásáról. Az említett vegyúletek közül a leghatékonyabb gyulladásgátlónak a TT-232 bizonyult, mely heptapeptid az előzetes vizsgálatok alapján nem

rendelkezik endokrin hatással, viszont hatékony antitumor hatású (Kéri és mtsai, 1993, 1996), és a nem-szteroid gyulladásgátlóktól eltérően (Xxxxxx-Xxxxx és Xxxxxxxxxx, 1970) hatékonyan gátolta a neurogén gyulladást is. Az endokrin hatásokat kiváltó octreotide az sst2, 3 és 5 receptorokat izgatja és hatékony hormonszekréciógátló analóg, de gyulladásgátlásban nem bizonyult hatásosnak (Holland es mtsai, 1995) es sajat vizsgálataink szerint a neurogén gyulladást sem gátolta Az általunk vizsgált hatások tehát valószínűleg az irodalmi adatok alapján külön csoportba sorolható sstl és/vagy sst4 receptorokon (Reisine 1995) keresztül valósulnak meg. Ez annál is inkább nagy jelentőséggel bír, mivel az eddig vizsgált vcgyületek elsősorban az sst2-3 receptorokon voltak hatásosak.

Jelen kísérleteink célja a TT-232 további vizsgálata volt akut neurogén, valamint krónikus kevert gyulladásban, különös tekintettel a hatás időtartamára, továbbá a TT-232 hatásmechanizmusára.

Módszerek

1. Neurogén gyulladást gátló hatás vizsgálata

Natrium pentobarbitallal (Nembutal, 40 mg/kg, i.p.) altatott 150-200 g-os nőstény Wistar patkányban a hátsó végtagok akut, bilaterális denerválását követően a lábhátak orthodrómos neurogén gyulladását 1 %-os mustárolaj ecsetelésével váltottuk ki. A plazma extravazációkat az Evans kék akkumulációs módszerrel határoztuk meg. A vizsgált anyagot (TT-232) s.c. alkalmaztuk 1, 2, 4, illetve 6 órával a gyulladáskeltő stimulus előtt 10, 20, 40,

80, 160, valamint 320 p.g/kg dózisban, csoportonként 5-7 állatnál. A hosszú (16 órás) hatás vizsgálatára, egy külön csoportban az állatok a kísérletet megelőző napon 2x500 p.g/kg dózisban kapták a TT-232-t (n=5-7/csoport).

A különböző időpontokban felvettük a dózis-hatás görbéket és regressziós egyenes

segítségével meghatároztuk az ID35 értékeket.

2 -pT-232 tartós hatása Freund-adjuváns indukálta krónikus arthritisre

A krónikus ízületi gyulladás kiváltására 0.1 ml komplett Freund-adjuvánst (elölt, szárított Mycobacteriumok paraffinban oldva) (Thesien-Popp és Xxxxxx-Xxxxxxxxxxx, 1994) fecskendeztünk a bal talp bőrébe intraplantárisan, valamint a szisztémás hatás fokozása céljából az első két napon a faroktőbe. A térdízületi duzzanat mérése plethysmométerrel történt a gyulladáskeltő anyag alkalmazását megelőzően, majd a 2., 5., 8., 12., 15. és 18. napon a

kezelés alatt. Az ízületi duzzadás mértékét a kontroll értékekhez viszonyítva százalékban adtuk meg A TT-232-t szintén s.c. alkalmaztuk 2x100. 2x200, illetve 2x500 ug/kg/nap dózisban a 18 napos időszakban, a kontroll csoportot a TT-232 oldószerével kezeltük (n=8/csoport).

Statisztikai értékelésre nem-parametrikus Mann-Whitney tesztet használtunk.

Szignifikánsnak P<0.05 esetén értékeltük az adatokat (* P<0.05. ** P<0.01).

3. Neuropeptidek in vitro felszabadulásának vizsgálata tracheapreparátumon

A natrium pentobarbitallal (40 mg/kg, i.p.) narkotizált patkányok tracheáit kimetszettük és szervíürdőnkent (1.8 ml) 2-2 szervet 37 °C-os oxigenizalt (95 % 0 2 es 5 % C 02) Krebs oldattal 60 percen át perfündáltuk (1 ml/perc). Az atáramlas leállítása után az előző fejezetben (II./I.) leírtaknak megfelelően 3 frakciót gyűjtöttünk (ingerlés előtti - ingerelt - ingerlés utáni). A peptidfelszabadulást elektromos téringerléssel (40 V, 0.1 ms, 10 Hz, 120 s) váltottuk ki és a frakciók SP, CGRP és szomatosztatin koncentrációit intézetünkben kifejlesztett specifikus RIA

mennyiségét fmol/mg egységben, nedves szövetsúlyra vonatkoztatva fejeztük ki.

A szomatosztatint 10, 50, valamint 200 nM dózisban alkalmaztuk, ebben az esetben természetesen csak SP és CGRP felszabadulást mértünk.

A TT-232-t 200, 500, illetve 1500 nM dózisban alkalmazva meghatároztuk az IC5o értékeket. A receptoriális hatás igazolására elektromos téringerlés esetében, egy külön csoportban az 500 nM TT-232 mellett pertussis-toxint (PTX) (100 ng/ml) is adtunk a szervfurdőbe, mely G-protein gátlásán keresztül fejti ki hatását. A PTX hatását önmagában is megvizsgáltuk, valamint tirozin-kináz gátló genisteinnel (50 pM) is elvégeztük az elektromos téringerlést annak eldöntésére, szerepet játszik-e a TT-232 tirozin-kináz gátló aktivitása (Kéri és mtsai, 1993, 1996) a gyulladásgátló hatásban (n=6/csoport).

A TT-232-böl Na-acetát-ecetsav pufferben (0.2 mol/1, pH:3.4) 5 mg/ml-es törzsoldatot készítettünk és a további oldásokat ebből 5 % mannitol hozzáadásával végeztük. A kontroll csoportokban az állatokat a mannitolt tartalmazó Na-acetát-ecetsav pufiferre! kezeltük.

Statisztikai értékelésre páros és páratlan Student t-próbákat használtunk. Statisztikailag szignifikánsnak P<0.05 esetén értékeltük az adatokat (* P<0.05, ** P<0.01).

F.redmények

1. A s.c. alkalmazott TT-232 (10, 20, 40, 80, 160, 320 és 2x500 pg/kg) dózisfúggően gátolta a mustárolajjal kiváltott akut neurogén gyulladást 1, 2, 4, 6 és 16 órával az előkezelés után. Az 1, 2, 4, 6 oras ÍD^ ertekek a következők: 20.26, 32.40, 39.Só es 78.22 pg/kg. A

16 órával a mustarolajecsetelessel kiváltott neurogen gyulladást még 52.09±3.8 %-kal gátolta.

2. A krónikus ízületi gyulladást a TT-232 dozisfuggóen gátolta (2x100, 2x200 es 2x500 pg/kg naponta, s.c.) (11171. táblázat), mely jelentősebb mértékét a legnagyobb dózis esetében ért csak el (III/1. ábra). A kontroll állatokban a Freund-adjuvánssal kezelt bal lábak kifejezett, az ellenoldali lábak enyhébb duzzanata volt észlelhető, a szisztémás jelek (étvágytalanság, mozgás hiánya, gyengeség) mellett.

Napok	Kontroll Jobb Bal		2x100 pg/kg Jobb Bal		2x200 pg/kg Jobb Bal		2x500 Jobb	pg/kg Bal
		45.19		33.92	0.79	36.82	1.47	19.66
2.		±5.63		±2.98	±1.31	±4.79	±3.12	±3.06**
	12.14	62.36	14.88	58.99	8.82	48.97	6.50	33.08
5.	±3.33	±3.61	±2.81	±6.37	±2.22	±4.31	±2.74	±4.75**
	15.69	69.79	17.01	62.22	11.54	53.08	8.90	36.88
8.	±3.11	±3.90	±3.74	±4.01	±3.23	±4.21*	±3.29	±3.97**
	21.35	75.13	18.43	58.62	16.11	54.83	8.63	46.01
12.	±2.83	±4.30	±3.25	±3.08**	±2.24	±4.08**	±2.67*	±4.33**
	25.34	70.87	26.38	61.06	15.72	55.51	10.47	44.15
15.	±3.28	±4.19	±4.22	±3.72	±2.20	±3.01*	±3.49**	±3.27**
	24.16	71.62	25.88	60.64	20.34	59.96	10.76	41.38
18.	±3.41	±6.30	±3.13	±3.31	±2.14	±1.23	±4.39*	±4.77**

Ill/1. táblázat. TT-232 s.c. kezelés hatása a hátsó lábak Freund-adjuvánssal kiváltott krónikus ízületi gyulladására plethysmométerrel merve (%-os duzzadás az 1. napi énékhez viszonyítva,

* P<0.05, ** PO.01).

2.2

- v - BAL (kontroll, KA.)

• ü • BAL (TT-232 kezeit, F A. JOBB (kontroll)

— JOBB (TT-232 kezelt)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

ITT/1. ábra. TT-232 (2x500 pg/kg/nap, s.c.) hatása Freund adjuvánssal kiváltott ízületi gyulladásra.

3. Szomatosztatin kis dózisokban nem fejtett ki szignifikáns hatást, azonban 200 nM SP, valamint CGRP elektomos téringerlés hatására történő felszabadulását 16.77, illetve 23.2

%-kal gátolta.

SP, CGRP és szomatosztatin izolált tracheából elektomos téringerlés hatására történő felszabadulását a TT-232 200 nM: 20.1 %-kal (SP), 23.2 %-kal (CGRP), 15.6 %-kal

(szomatosztatin); 500 nM: 39.8 %-kal, 51.8 %-kal, illetve 40.6 %-kal; 1500 nM: 61.5 %-kal,

80.4 %-kal, illetve 62.5 %-kal gátolta. Az IC50 értékeket kiszámolva 1033.5, 607.4, valamint

922.4 nmol/1 értéket kaptunk az SP, CGRP, illetve szomatosztatin esetén. A bazális, stimuláció nélküli peptidfelszabadulást a TT-232 nem befolyásolta. A PTX a TT-232 gátló hatását kivédte, a peptidfelszabadulást helyreállította, ami a G-protein függő receptoriális hatást igazolja. Önmagában a PTX, valamint a genistein nem befolyásolta az elektromos téringerléssel kiváltott peptidfelszabadulást (III/2. táblázat).

Frakciók	Kontroll	TT-232	PTX	PTX+TT-232	Genistein
1SP (fmol/ms)	1.77 ±0.08	1.79 ± 0.15	1.84 + 0.08	1.79 + 0.14	1.90 + 0.12
2.	5.96 ± 0.15	4.47 ± 0.30 *	5.81 ±0.32	5.90 + 0.38	5.93 ± 0.38
3.	2.48 ±0.22	2.11 ±0.12	2.03 ±0.13	1.97 + 0.16	2.11+0.16
1 CGRP (fmol/mg)	0.17 ± 0.01	0.16 ± 0.01	0.20 ±0.02	0.19 ±0.02	0.19 ±0.02
2 -	0.69 ± 0.05	0.43 ± 0.05 *	0.70 ± 0.06	0.72 ±0.04	0.66 ±0.04
3	0.19 ±0.02	0.18 ±0.01	0.26 ±0.02	0.26 ±0.03	0.27 ±0.02
1SOM (fmol/ms) 2	0.18 ±0.01	0.19 ± 0.01	0.19 + 0.02	0.19 + 0.01	0.18 ±0.01
1SOM (fmol/ms) 2
	0.51 + 0.01	0.38 + 0.02 *	n 48 + n	n sn + nm	n 46 + n np
3-	0.21 ±0.01	0.20 ±0.02	0.21 ±0.01	0.22 ±0.03	0.19 ± 0.01

III/2. táblázat. Elektromos téringerléssel (40 V, 0.1 ms, 10 Hz, 120 s) kiváltott neuropeptid felszabadulás izolált patkány tracheapreparátumon. TT-232 (500 nM), PTX (100 ng/ml), PTX+TT-232, valamint genistein (50 (iM) hatása. (1. frakció: alapérték, 2. frakció: ingerelt periódus, 3. frakció: kimosás utáni érték, * P<0.05)

Következtetés

A TT-232 stabil, ciklikus, szintetikus heptapeptid szomatosztatin analóg rendkívül hatékonynak bizonyult mind az akut neurogén plazma extravazáció, mind a krónikus kevert ízületi gyulladásos folyamat gátlásában. Kísérleteink alapján hatása subcután alkalmazás esetén dózistól függően hosszan tart. Hatását döntően az idegvégződéseken, specifikusan a szomatosztatin receptorokon hatva a neuropeptid felszabadulás gátlásán kérésziül fejti ki, hatékonysága ebben a tekintetben az in vitro kísérleti adatok alapján megközelítőleg megegyezik a szomatosztatinnal. Bizonyított azonban a nem neurogén gyulladásra gyakorolt gátlása is, mivel a TT-232 denervált lábon kiváltott dextrán-ödémát is képes volt szignifikáns mértékben gátolni. Következésképpen a Freund-adjuvánssal kiváltott krónikus gyulladás csökkentésében feltehetően mind a neurogén, mind a nem neurogén gyulladást gátló hatása

szerepet játszik.

Az sst2, 3 és 5 receptorokon ható octreotide hatástalansága, továbbá az, hogy a patkány tracheán, illetve légutaiban ismereteink szerint csak sst4 receptor található (Hover és mtsai, 1994) arra utal, hogy a TT-232 hatását nagy valószínűséggel ezen a receptoraltípuson fejti ki hatékonyan, dózisfüggöen gátolva /// vitro a tracheából a peptidtelszabaduiast, melv gátló hatást a G-protein gátló P T \ kivédte Irodalmi forrásokból ismerünk szelektíven az sst4 receptoron ható agonistát (Ankersen és mtsai, 1998), azonban olyan sst4 antagonista, aminek segítségével a kérdés biztonsággal megválaszolható lenne sajnos nem állt rendelkezésünkre.

A TT-232 tirozin-kináz gátló aktivitása (Kéri és mtsai, 1993, 1996) a gyulladásgátló hatásában valószínűleg nem játszik szerepet, mivel a potens tirozin-kináz gátló genistein nem fejtett ki hasonló hatást a neuropeptid felszabadulásra.

Ezen eredmények jelentőségét az is hangsúlyozza, hogy bár régóta folynak vizsgálatok

az ismert nem-szteroid gyulladásgátlókkal kapcsolatban is, jelenleg egyetlen olyan gyógyszer

Xxxxxxxxxx, 1970, Xxxxxxxx és Xxxxxx 1996). A TT-232 in vivo tesztekben hatékonyabbnak bizonyult mint a szomatosztatin, lebomlása lassúbb, ezáltal hatása tartósabb és szelektívebb is, mert endokrin hatásoktól mentes. Mivel e heptapeptid gátolta in vitro a szenzoros neuropeptidek felszabadulását, feltételezhetjük, hogy a gyulladáscsökkentő és az anti- nociceptív hatás az afferens idegvégződések gátlásán keresztül valósul meg, hasonlóan az endogén szomatosztatinhoz.

HI B ENDOGÉN NEUROPEPTIDEK, ILLETVE TT-232 SZOMATOSZTATIN ANALÓG HATÁSA NEUTROPHIL LEUKOCYTAK AKKUMULÁCIÓJÁRA A BORBEN

A fejezethez kapcsolódó saját közlemény:

11LB./1. Than M., Xxxxxx E., Brain S.D., Xxxxxxxxxx A., Xxxxxxxxxx J.: Local and systemic effect of sciatic nerve stimulation on cutaneous neutrophil accumulation in the rat hindpavv.

Reeul. Peptides, 89, 84, 2000. (elöadaskivonat) Bevezetés

A neutrophil leukocyták akkumulációja az akut gyulladásos reakciók lényeges kísérője. Xxxxxx, hogy a neurogén gyulladásban szerepet játszó gyulladáskeltő neuropeptidek (SP, CGRP) fokozzák a neutrophil leukocyták akkumulációját (XxXxxxxx és Xxxxxxxxx, 1999), in vitro körülmények között az SP a neutrophil leukocytákra hatékony kemoattraktív, a szomatosztatin viszont gátló hatást fejt ki (Kolasinski és mtsai, 1992). Bizonyított az SP fontos szerepe a neutrophil leukocyta akkumuláció kiváltásában a légutak nyálkahártyájában in vivo, melyet tachykinin NK1 receptorok közvetítésével (Baluk és mtsai, 1995), illetve nagyobb koncentrációban egy nem-receptor függő, hízósejt közvetítette úton, feltehetőleg részben interleukin-1 felszabadításán keresztül vált ki (Matsuda és mtsai, 1989, Suzuki és mtsai, 1995).

Exogén SP képes a hízósejtekből gyulladásos mediátorokat felszabadítani (Xxxxx és Undem, 1995), ugyanakkor a bőrben endogén neuropeptidek által kiváltott neutrophil sejtakkumulációt eddig nem igazoltak.

Előzetes kísérleteinkben igazolódott, hogy n. ischiadicus perifériás csonkjának antidrómos elektromos ingerlésével felszabadított szomatosztatin a bőr nociceptorainak orthodrómos, vagy antidrómos stimulációjával kiváltott neurogén plazma extravazációra gátló hatást fejtett ki (Xxxxxxxxxx és mtsai, 1998a).

Kísérleteinkben megvizsgáltuk, hogy a n. ischiadicus elektromos ingerlésével felszabadított endogén neuropeptidekkel kiváltható-e a bőrben leukocyta akkumuláció, képes-e az így felszabadított szomatosztatin, valamint a TT-232 szomatosztatin analóg gátolni carrageenin gyulladás sejtes fázisát. A carrageenin növényi polysacharid, amely a gyulladást részben neurogén úton az afiferens idegvégzódesek aktivaciojaval, részben pedig a hízósejtek degranulálásán keresztül hozza létre (Pintér és Xxxxxxxxxx, 1996), gyors polymorphonuclearis leukocyta akkumulációs sejtes fázist kiváltva.

Módszerek

A kísérletet natrium thiopenthallal altatott (Trapanal, 100 mg/kg, í.p.) 200-220 g súlyú hím Wistar patkányokon végeztük.

1. Antidrómos idegingerléssel felszabadított endogén neuropeptidek hatása a neutrophil leukoeyták akkumulációjára a bőrben

.Az első kísérletsorozatban a n. ischiadicus elektromos ingerlésével felszabadított endogén neuropeptidek hatását vizsgáltuk a bőrben létrehozható leukocyta akkumulációi a. Guanethidin (20 mg/kg, s.c., 24 h) előkezelés után az állatokat pipecuronium bromiddal (200 pg/kg, i.v.) relaxáltuk és a kísérlet alatt tracheakanülön keresztül mesterségesen lélegeztettük. A n. ischiadicust jobb oldalon kipreparáltuk és az átmetszett ideg perifériás csonkját elektromosan ingereltük (20 V, 0.5 ms) a következő paraméterekkel: 1. csoport: 1 Hz, 4 h , 2.

csoport: 2 Hz, 4 h és 3. csoport: 10 Hz, 5 h (szakaszos ingerlés, 24 min ingerlés/h). A bal oldali ideg érintetlen maradt, és ehhez viszonyítottuk az ingerlés hatását, mint kontroll értékhez

2. Antidrómos idegingerlés hatása carrageeninnel a bőrben kiváltott leukocyta akkumulációra Ebben a kísérletsorozatban idegingerlés hatását vizsgáltuk az ellenoldali lábon

carrageeninnel kiváltott gyulladás neutrophil akkumulációs fázisára. A jobb oldali n. ischiadicus átmetszett perifériás csonkját elektromosan ingereltük (20 V, 0.5 ms, 0.5 Hz, 5 h). Az ingerlés megkezdése után 5 perccel az ellenoldali talp bőrébe 100 pl, 1 %-os carrageenin oldatot fecskendeztünk intradermálisan, majd a neutrophil akkumulációt 5 h elteltével mértük. Kontroll állatokban, a jobb oldali ideget csak átmetszettük, a bal oldali talpbőrbe 100 pl, 1 %-os carrageenint adtunk (n= 10).

3 TT-232 hatása carrageeninnel a bőrben kiváltott leukocyta akkumulációra

Az utolsó kísérletsorozatban a TT-232 hatását vizsgáltuk a carrageenin-kiváltotta gyulladás neutrophil leukocyta akkumulációs fázisára. A jobb oldali lábhát bőrébe 100 pl, 1

%-os carrageenin oldatot, ellenoldalra kontrollként a carrageenin oldószerét, 100 pl Tyrode oldatot fecskendeztünk intradermálisan. Az állatokat TT-232-vel kezeltük (20 pg/kg, i.v.) a carrageenin adás előtt 5 perccel, ezt követően az 55. és 115. percben, vagyis óránként. A neutrophil akkumulációt 3 h után mértük. A Tyrode oldattal kiváltott neutrophil akkumulációt levontuk a carrageeninnel kezelt lábon kapott értékből, és így vetettük össze a TT-232 kezelt, illetve az oldószerrel kezelt kontroll csoport értékeit (n=10).

4. Myeloperoxidáz mérésen alapuló leukocyta szám meghatározás

Az akkumulációs idő letelte után az állatokat elvéreztettük, a talp, illetve lábháti bőrök megegyező felületű darabját kimetszettük, feldaraboltuk és 2 ml, detergenst (0.5 % hexadecy! triethylammonium bromide) tartalmazó foszfat-putlerben homogenizáltuk. Ezután a homogcnizátumot lecentrifugáltuk (10000 g 5 min. 4 °C) hogy a szövetdarabokat valamint iipidfazist eitavoiitsuk. A szupernatans 1 ml-ét használtuk a myeloperoxidáz vizsgalathoz.

A bőrben akkumulálódott neutrophilek számát a minták myeloperoxidáz tartalmának fotomctriás mérésén keresztül kaptuk meg (Schierwagen és mtsai, 1990). A bőrminták myeloperoxidáz aktivitását “3,3’5,5’tetra-methylbenzidine (TMB) liquid substrate system” (Sigma) hozzáadásával határoztuk meg (25 pl minta + 25 pl puffer + 100 pl szubsztrát). A kékülési reakció szobahőmérsékleten megy végbe, 30 perc alatt. Az optikai denzitást (OD) 620 nm-en mertük microplate reader-rel, 5 percenként. Az ismert neutrophiltartalmú standard

nappal (Xxxxxxx és mtsai, 19SS). A standard higítási sor OD értékeinek változása alapján felvett görbe kezdeti (első 5 perces) szakaszának segítségével határoztuk meg az ismeretlen minták neutrophil leukocyta tartalmát.

Statisztikai elemzéshez nem-parametrikus Mann-Withney tesztet használtunk, statisztikalilag szignifikásnak P<0.05 esetén értékeltük az eredményeket (* P<0.05, ** PC0.01).

Eredmények

1. N. ischiadicus perifériás csonkjának különböző paraméterekkel végzett antidrómos ingerlése nem váltott ki leukocyta akkumulációt a bőrben, sem az alacsony frekvenciával (1 Hz, 2 Hz) végzett folyamatos, sem a 10 Hz-es megszakított ingerlés esetén (III/2. ábra).

2. N. ischiadicus egyoldali antidrómos ingerlésével felszabadított szomatosztatin az ellenoldalon carrageeninnel kiváltott neutrophil akkumulációt szignifikáns mértékben, 54.7±3.8

%-kal gátolta (III/3. ábra).

3. TT-232 (20 pg/kg/óra, i.v.) kezelés a lábhát bőrében carrageeninnel kiváltott neutrophil akkumulációt 61.7±5.9 %-kal gátolta, a solvens-kezelt kontrollokhoz viszonyítva (III/4. ábra).

Neutrophil leukocyták (10 / talpbőr)

r 43

Neutrophil leukocyták (10 /talpbőr)

(20 V, 0.5 ms) után az innervált talpbőrben.

III/3. ábra. N. ischiadicus elektromos ingeriésenek (20 V, 0.5 ms, 5 h, 0.5 Hz) hatása carrageeninnel kiváltott neutrophil leukocyta akkumulációra az ellenoldali talpbőrben.

r 44

kontroll

III/4 ábra. TT-232 (20 pg/'kg/ora, i.v.) hatása carrageeninnel kiváltott neutrophil leukocyta akkumulációra a iabbati bőrben (3 np

Következtetések

A n. ischiadicus antidrómos ingerlésével kiváltott neurogén gyulladás során kísérleteinkben a felszabadított endogén neuropeptidek (SP. CGRP) nem váltottak ki a bőrben neutrophil leukocyta akkumulációt. Ennek ellentmondó egyes irodalmi adatok igazolják, hogy az SP hízósejteken kifejtett proinflammációs citokineket (TNF-a, IL-1) felszabadító hatasa mellett az exogén SP, valamint CGRP a vasculáris endothélsejtek korai adhéziós molekuláinak (E-selectin, P-selectin) expresszióját is képes fokozni (DeRose és mtsai, 1994, Xxxxx és mtsai, 1993). Valószínű azonban, hogy az idegingerlésre ennél jóval kisebb mennyiségben felszabaduló endogén SP nem elégséges ilyen tartós hatások kiváltásához.

Érdekes módon az idegingerlessel felszabadított endogén szomatosztatin ezzel szemben képes volt gátolni a carrageeninnel kiváltott gyulladás sejtes fázisát. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a capsaicin-érzékeny szenzoros idegvégzödesekből felszabaduló szomatosztatin a keringésbe jutva már alacsony, 0.5 Elz-es ingerlés esetében is képes a leukocyták akkumulációját gátolni. Hasonló hatást fejtett ki a TT-232 szomatosztatin analóg is, ami igazolja, hogy gyulladásgátló hatásának a már igazolt neuropeptid felszabadulást gátló hatáson kívül a gyulladásos sejteket gátló komponense is van.

A szomatosztatinról ismert, hogy a gyulladásos, illetve immunsejteken gátló hatást fejt ki, így a T-lymphocyták proliferációját, a B-lymphocyták immunglobulintermelését, valamint a hízósejtek, illetve basophil leukocyták degranulációját gátolja (Xxxxxxxxxx és mtsai, 1992) Neutrophil leukocyta akkumulációt gátló hatását feltehetőleg részben ezen a hízósejt-mediált indirekt úton fejti ki, emellett szerepet kap az idegvégzódésekbö! az SP felszabadulás gátlása is, valamint nem zárható ki a neutrophil leukocvták szomatosztatin receptorain kifejtett direkt hatása sem. A leukocyták kitapadásának, illetve szöveti akkumulációjának feltétele egyes adhéziós molekulák fokozott expressziója a leukocyták membránjában (L-selectin, CD 18, CD 11), illetve a vasculáris endothelsejteken (E-selectin, P-selectin, ICAM-1) (Panes és mtsai, 1999). Eddig ugyan nem igazolták, de valószínűleg a szomatosztatin az adhéziós molekulák expresszióját is hatékonyan képes gátolni.

A nem-szteroid gyulladásgátlókról ismert, hogy stimulálják egyes adhéziós molekulák (ICAM-I, CD 18) expresszióját, melyek elősegítik a leukocyták kitapadását az endothélhez

proteolitikus enzimek fontos szerepet játszanak a nem-szteroid gyulladásgátlók egyik komoly szövődményének, a gastrointestinális fekély kialakulásában (Xxxxxxx és mtsai, 1993). A TT-

232 leukocyta akkumulációt gátló hatása újabb előnyt jelenthet az eddig használatos gyulladáscsillapítókkal szemben.

IV SP, CGRP ES SZOMATÜSZTATIN FELSZABADULÁSÁNAK VIZSGÁLATA A CAPSAICIN-ERZEKENY PRIMER AFFERENS NEURONOK VÉGZŐDÉSÉIBŐL ELEKTROMOS INGERLÉS, VALAMINT CAPSAICIN ANALÓGOK HATASARA

A fejezethez kapcsolódó saját közlemények'

IV./I. Xxxxxx X , Xxxxxx G., Than M., Xxxxxx Zs., Xxxxxx E., Xxxxxx B, Xxxxxxxxxx J : Substance P radioimmunoassay for quantitative characterization of sensory neurotransmitter release.

Neurobiology, 7. 437-444, 1999.

IV./2. Xxxxxx X , Xxxx X., Xxxxxx Zs., Xxxxxx G , Xxxxxx F„ Szolcsánvi J Substance P radioimmunoassay for quantitative characterization of sensory neurotransmitter release.

Neurobiology, 7, 360, 1999. (elöadáskivonat)

IV./3. Xxxx, M., Xxxxxx, X., Xxxxxx, Zs., Xxxxxx, X., Szolcsánvi, J.: Release of somatostatin and CGRP from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in vitro and in vivo.

Neurobiology, (közlésre elfogadva) 2000. (előadáskivonat) Bevezetés

A capsaicm-erzekeny afferens neuronok perifériás végződéséi kettős, „szenzoros- efferens” funkcióval rendelkeznek (Xxxxxxxxxx 1984, Maggi 1995), azaz kémiai vagy elektromos ingerlés az idegvégződésekben tárolt szenzoros neuropeptidek (tachykininek, CGRP, szomatosztatin) felszabadulását eredményezi, amelyek mediátor szerepe testszerte kimutatható. Míg az elektromos ingerléssel kiváltott peptidfelszabadulás tetrodotoxinnal (TTX), valamint co-conotoxinnal (CTX) kivédhető, a kémiai inger hatása Ca2+ függő, de TTX és CTX rezisztens, amely arra utal, hogy axonális vezetés, illetve feszültségfüggő N-típusú Ca2+ csatornák részvétele nélkül jön létre (Szolcsányi 1983, 1996a, Maggi 1995). A capsaicin és analógjainak izgató, illetve peptidfelszabadító hatása capsazepinnel, illetve ruthenium vörössel azonban blokkolható (Xxxxxxxxxx 1996a). Az elektromos, illetve kémiai stimulációval kiváltott neuropeptid felszabadulás tehát két eltérő mechanizmussal történik.

Napjainkban már több, a VR1 receptoron szelektíven ható szintetikus, illetve természetes analóg ismert. Szoros szerkezet-hatás összefüggést az agonisták egyes csoportjain belül lehet találni, de míg például a vanilloid struktúra kritikus a capsaicin esetében, nem jelentős az RTX molekulánál, ahol a diterpen vázon található ketocsoport hiánya jár a hatás elvesztésével (Xxxxxxxxxx és Xxxxxx-Xxxxx, 1975, Xxxxxxxxxx, 2000a,b). A capsaicin analógok nemcsak receptoraffinitásukban, hanem csatornanyitási kinetikájukban is különböznek (Szállási és Blumberg, 1999). Mivel a különböző áramkinetikáknak jelentős hatása van a membrán depolarizációra és így a fájdalomérzésre is, nem vonható direkt kapcsolat a receptoraffimtás es

az izgató hatás között. Az RTX a capsaicinhez hasonló hatásokat képes létrehozni (Szállási es Blumberg, 1989 és 1990, Blumberg és mtsai, 1993), azonban a hatáserősségben nagyságrendbeli különbségek vannak, egyes tesztekben az RTX 100 - 1000-szer hatékonyabbnak bizonyult (Szállási és Blumberg, 1990, Blumberg és mtsai, 1993) Mindezeken túl a két vegyület lényegesen különbözik abban is, hogy az RTX receptoraffinitása nagyobb, csatornanyitási kinetikája lassúbb, ami magyarázhatja voltage-clamp vizsgálatokban a capsaicin, illetve RTX kiváltotta áramok eltérő sajátosságait, Lz okozhatja az eltérésekét a két vegyület között az izgató, azaz fájdalomkeltő, illetve deszenzitizáló hatásukban (Szállási és Blumberg, 1999). Különböző receptor szubtípusok jelenlétét, vagyis a feltételezett „R” (RTX) és „C” (capsaicin) receptort (Szállási és Xxxxxxxx, 1993, Ács és xxxxx, 1997) a klónozott VR1 receptoron kimutatott közös támadáspont (Xxxxxxxx,és mtsai, 1997), valamint a VR1 receptor knockout egereken kapott eredmények kizárják (Xxxxxxxx és mtsai, 2000, Xxxxx és mtsai, 2000). Lehetséges azonban, hogy a VR1 receptoron specifikus felismerő hely van a

nyitásért, tehát az izgató hatásért, a második pedig a lassúbb aktiváció következtében elsősorban a Ca2+ felvételen keresztül a tachyphylaxiáért, illetve a deszenzitizációért (Szállási és Blumberg, 1999).

Szállási (1996) és Szállási és Xxxxxxxx (1999) feltételezései szerint az RTX a VR1 receptorhoz kötődve képes deszenzitizációt létrehozni előzetes izgatás nélkül. A pulmonáris J receptorok deszenzitizációját a Xxxxxx Xxxxxx reflex kiváltása nélkül (Xxxxxxxxxx és xxxxx, 1990) azonban a társszerzőkkel ellentétben Xxxxxxxxxx olyan agonista hatással magyarázza, ami ugyan a VR1 receptor aktivációval jár, azonban az akciós potenciál frekvenciája elmarad a reflex kiváltásától. Ezen egymásnak ellentmondó vélemények birtokában érdekes feladat volt a capsaicin, valamint az RTX akut izgató és akut deszenzitizáló hatásának vizsgálata és összehasonlítása in vitro körülmények között a szenzoros neuropeptidek felszabadulásának meghatározása alapján.

Kísérleteinkben in vitro, perfúziós rendszerben vizsgáltuk izolált patkány trachea afferens idegvégződéseiből különböző frekvenciákkal végzett elektromos ingerlésre, illetve kémiai ingeranyagok (capsaicin, RTX, piperin) hatására történő neuropeptid transzmitterek (SP, CGRP, szomatosztatin) felszabadulását, ennek frekvencia, impulzusszám, illetve dózisfuggését, valamint az akut deszenzitizáció jelenségét.

Módszerek

Kísérleteinkhez 200-240 g súlyú nősténv Wistar patkányokat natrium pentobarbital ("Nembutal, 40 mg/'kg, i.p.) altatásban elvéreztettünk. Tracheáikat kimetszettük es szervfürdőben az előzőekben leírt (II./I. fejezet) módon 60 perein, perfundáltuk (! ml/perc). Az átaramlas leállítása után a kamrákban levő oldatot 8 percenként 3-szór iecsereive frakciókat gyűjtöttünk (ingerlés előtti - ingerelt - ingerlés utáni).

Az elektromos téringerlést 40 V, 0.1 ms paraméterekkel a második periódus 5. percében kezdtük különböző frekvenciákkal: (0.5 Hz, 200 s), (2 Hz, 50 s), (2 Hz, 150 s), (10 Hz, 30 s), illetve (10 Hz, 120 s), hogy páronként különböző frekvenciákkal azonos impulzusszámot adjunk le.

Kémiai ingerlésre capsaicint (1 Ú's- 10"' M), RTX-t (10'10-10"7 M) valamint piperint

adtunk a rendszerhez. Az RTX esetén egy középdózisnál (10"s M) 6 frakciót gyűjtöttünk, azaz az expozíciót követő kimosás után még 32 percig követtük a felszabadulás dinamikáját.

Az akut deszenzitizáció létrehozása különböző dózisokkal végzett 30 perces capsaicin (10"8-10‘5 M), illetve RTX (1 O'10- 1O’7 M) előmosással történt, ami után elektromos téringerléssel (40 V, 0.1 ms, 10 Hz, 120 s) váltottunk ki peptidfelszabadulást és a gátló hatást az elektromos téringerlés kontroll értékéhez viszonyítva számoltuk. Capsaicin akut deszenzitizáló hatását kémiai ingerrel, 10"7 M capsaicinnel kiváltott neuropeptid felszabadulásra is megvizsgáltuk. A mintákat jégbe hűtött csövekbe gyűjtöttük és a kísérlet végén a légcsődarabok nedves súlyát lemértük. A frakciók SP, CGRP és szomatosztatin koncentrációit specifikus RIA módszerek segítségével határoztuk meg (Németh és mtsai, 1996, 1998a, 1999). A peptidek mennyiségét fmol/mg egységben, nedves szövetsúlyra vonatkoztatva fejeztük ki (n=6 minta/csoport).

Az eredmények statiszikai értékelése Student-féle páros és páratlan t-teszttel történt. Statisztikailag szignifikánsnak P<0.05 esetén értékeltük az adatokat ( * P< 0.05, ** P< 0.01).

F.redménvek

1. Elektromos téringerlés 100 impulzus alkalmazása esetén 0.5 Hz és 2 Hz-es ingerlési frekvencián hasonló mértékű SP. CGRP és szomatosztatin felszabadulást váltott ki. Azonos számú impulzus eseten 0.5 Hz es 2 Hz-es, illetve 2 Hz es 10 Hz-es ingeriesnel nem volt szignifikáns különbség Elektromos ingerlés tehát a három szenzoros neuropeptid impulzusszámfüggö felszabadulását váltotta ki, ami 10 Hz-es ingerlésnek az impulzusszam 4- szeres növelése esetén szignifikánsnak bizonyult (IV/1. ábra).

2. Mindhárom ingeranyag koncentrációfüggő peptidfelszabadulást eredményezett. Az RTX már 10"10 M, a capsaicin 10'8 M koncentrációnál váltott ki szignifikáns emelkedést a frakciók SP, CGRP, illetve szomatosztatin koncentrációjában a bazális szinthez képest (IV/2. ábra), míg a piperin 50-100-szor gyengébbnek bizonyult, csak 10" M koncentracioban váltott

Az ingeranyagok nagyobb dózisánál a kimosás utáni 3. frakcióban is emelkedett értékeket kaptunk, így a IV/1. táblázatban a 2+3 frakció együttesen vett értékeit tüntettük fel. Az RTX lassú, elhúzódó peptidfelszabadulást váltott ki, mely 10'8 M esetén még a 3., 4. és 5. frakcióban a vegyület kimosása után is megfigyelhető volt (IV/3. ábra).

CGRP (finol/mg)

SP (fhioPmg)

SOM (fmol/mg)

ábra. Elektromos téringerléssel kiváltott szenzoros neuropeptid felszabadulás in vitro.

10'8 M 10-7 M 10"6 M ío '5 M

IV/2. ábra. Capsaicinnel kiváltott szenzoros neuropeptid felszabadulás in vhro.

Capsaicin (M)	10‘8		10'7			in-6 1	( \| 1 in-* i I ^ I
SP (fmol/mg)	1.43 ~ 0.1I		1.54 r 0.18			2.3 1 ± 0.33	3.52 ± 0.36 i
CGRP (fmol/mg)	0.30	±0.02	1.01	±	0.05	3.8° ^ 0.14	406 —0.19 í i
SOM (fmol/mg)	0.25	±0.01	0.33	±	0.02	0.56 ± 0.03	0.73 ±0.06 j

IV/l,a. táblázat. Abszolút peptidfelszabadulás (2.+3. frakcióban együttesen) capsaicin hatására izolált patkány tracheapreparátumon. (A táblázatban feltüntetett értékek mind szignifikánsan különböznek a bazális értéktől, ** P<0.01.)

RTX (M)	10 10	10 9	10*	10 7
SP (fmol/mg)	1.07 ±0.09	1.39 ±0.12	1.73 ±0.20	3.96 ±0.38
CGRP (fmol/mg)	0.26 ±0.02	0.57 ±0.06	1.37 ±0.14	3.55 ±0.31
SOM (fmol/mg)	0.10 ±0.01	0.13 ±0.02	0.24 ±0.03	0.41 ± 0.03

IV/l.b. táblázat. Abszolút peptidfelszabadulás (2.+3. frakcióban együttesen) RTX hatására izolált patkány tracheapreparátumon. (A táblázatban feltüntetett értékek mind szignifikánsan különböznek a bazális értéktől, ** P<0.01.)

Piperin (M)	2x10 6	10 5	5x10 3
SP (fmol/mg)	0.49 ±0.04	0.67 ±0.08	2.50 ±0.23
CGRP (fmol/mg)	0.06 ±0.01	0.18 ±0.02	0.75 ± 0.08
SOM (fmol/mg)	0.06 ±0.01	0.09 ±0.02	0.38 ±0.03

IV/l.c. táblázat. Abszolút peptidfelszabadulás (2.+3. frakcióban együttesen) piperin hatására izolált patkány tracheapreparátumon (* P<0.05, ** P<0.01).

SOM (fmol/mg)

CGRP (fmol/mp)

sp (ímol/mg)

IV73. ábra. RTX (10'XM) kiváltotta szenzoros neuropeptid felszabadulás dinamikája.

2. A küszöbkoncentrációkhoz hasonlóan az akut deszenzitizációt tekintve is az RTX szintén közel 100-szor hatásosabbnak bizonyult a capsaicinnél, azonban a vizsgált három peptid érzékenysége között ebben a tekintetben is eltérést tapasztaltunk. Capsaicin, illetve RTX a CGRP felszabadulását már 10"7/ 10'9, a szomatosztatinét l(Y'7lf)'ii, az SP-ét csak 10'5. illetve ICC M koncentracioban védte ki. A capsaicin es az RTX tehat egyaránt iegkisebb koncentrációban a CGRP. majd a szomatosztatin és végül az SP felszabadulását gátolta. (TV/2.

a. és b. táblázat, 1V/4. ábra).

Caps. (M)	Kontr.	10 8	gátlás	10 7	gátlás	10 6	gátlás	10°	1
SP (finol/mg)	4.91 ± 0.19	4.48 ± 0.31	8.7 %	4.43 ± 0.36	9.8 %	4.36 ± 0.45	11.2 %	2.90 ± 0.36 **	40.9 %
CGRP (fmol/mg)	0.54 ± 0.04	0.50 ± 0.05	7.4 %	0.37 ± 0.02 **	31.5 %	0.14 ± 0.01 **	74.1 %	0.02 ± 0.01 **	99.6 %
SOM (fmol/mg)	0.02	0.04	"	0.03		0.02 **		0.02 **

IV/2.a. táblázat. Elektromos téringerlés (1200 imp.) hatására történő abszolút peptidfelszabadulás kontroll esetben, valamint capsaicin különböző koncentrációjú oldataival történt 30 perces előmosás után. A százalékos gátlás számításakor a kontroll értéket tekintettük 100 %-nak (** P<0.01).

RTX (M)	Kontr.	IQ-IO	gátlás	10 y	gátlás	10 8	gátlás	107	gátlás
SP (fmol/mg)	4.91 ± 0.19	4.44 ± 0.24	9,6 %	4.72 ± 0.38	3.9 %	4.49 ± 0.46	8.6 %	3.30 ± 0.26 **	32.8 %
CGRP (fmol/mg)	0.54 ± 0.04	0.46 ± 0.04	14.8 %	0.32 ± 0.03 **	47.7 %	0.19 ± 0.01 **	64.8 %	0.17 ± 0.02 **	68.5 %
SOM (fmol/mg)	0.34 ± 0.02	0.30 ± 0.03	11 8 %	0.29 ± 0 01	14.7%	0.22 ± 0 02 **	3 5 3 %	0.16 ± 0 01 **	52 9 %

IV/2.b. táblázat. Elektromos téringerlés (1200 imp.) hatására történő abszolút peptidfelszabadulás kontroll esetben, valamint RTX különböző koncentrációjú oldataival történt 30 perces előmosás után. A százalékos gátlás számításakor a kontroll értéket vettük 100 %-nak (** P<0.01).

SP (fmol/mg)

rm

CGRP (fmol/mg)

0,7

SOM (finol/mg)

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0

Kontroll 10"8M 10"7M 10'6M 10° M

IV/4. ábra. Capsaicin különböző koncentrációjú oldataival történt előmosás (30 min) akut deszenzitizáló hatása capsaicinnel kiváltott szenzoros neuropeptid felszabadulásra in vitro.

Következtetések

Eredményeink igazolták, hogy elektromos teringerlés esetén a peptidfelszabadulás a rapsaicin-erzekeny ideuveuzödesekböl a ieadott impulzusszamtul iugg. es Ü.5-10 Iíz-es tartományban nem függ az ingerlés frekvenciájától. Bizonyított, hogy a capsaicin-érzékeny érzőrostok 0.1-1 Hz-cel végzett ingerlése mar kepes maximalis vazodilatacios etTerens választ kiváltani in vivo, a plazma extravazáció frekvenciaoptimuma pedig 2 Hz. (S/xxxxxxxx 1996a) Kísérleteink igazolják, hogy 0.5 Hz-es téringerlés hatását a frekvencia növelésével a szomatosztatin, CGRP, valamint SP felszabadulásra nem lehet tovább növelni. Magasabb frekvencián (10 Hz) végzett ingerlés esetén egyértelműen bizonyított azonban, hogy a magasabb impulzusszám nagyobb mértékű neuropeptid felszabadulást vált ki a capsaicin- érzékeny idegvégződésekből.

A capsaicin analógokkal kapott eredmények igazolták, hogy mind a capsaicin, mind az RTX és a piperin akut izgató hatást fejt ki a capsaicin VR1 receptoron, koncentrációfüggő neuropeptid felszabadulást okozva. A vizsgált analóg vegyületek között nagyságrendbeli különbségeket találtunk: RTX > capsaicin > piperin. Az RTX hosszan tartó peptidfelszabadító hatása valószínűleg a bevezetőben már említett lassú receptorkinetikából, valamint tartós depolarizációból ered (Szállási és Xxxxxxxx, 1999). Eredményeink azt is igazolják, hogy CGRP és SP szimultán felszabadulása mellett szomatosztatin is felszabadul a capsaicin- érzékeny idegvégzödések elektromos, illetve kémiai ingerlésére. Az SP, valamint a CGRP fajtól, az érzőneuron típusától és az innervált területtől függően (exteroceptív/interoceptív) különböző, de jellemzően nagymértékben kolokalizáltan fordul elő az idegsejtekben. Patkány- hátsó gyöki ganglionsejtek esetén az SP pozitívak szinte minden esetben tartalmaznak CGRP-t is (Xxxxxx 1996), szomatosztatinnal a kolokalizáció azonban jóval kisebb mértékű, bár egyes irodalmi adatok szerint kimutatható mind az SP, mind a CGRP tartalmú rostokban (Dalsgaard 1987). A viscerális afferensek szinte mindegyike CGRP-, nagy többsége pedig SP-pozitív, azonban a szomatosztatin pozitivititás itt igazoltan kisebb arányú, mint a bőrben (Xxxxxx 1996).

Akut deszenzitizációt tekintve az RTX szinten közel lUO-szor hatásosabbnak bizonyult a capsaicinnél. A capsaicin kiváltotta klasszikus deszenzitizáció hátterében a szenzoros neuropeptidek, valamint a VR1 receptorok depléciója, illetve az idegrostok degeneratív károsodása áll, azonban később kimutatták, hogy a capsaicin-deszenzitizáció megalapozott lehet anélkül is, hogy a szenzoros neuropeptidek szöveti szintjének szignifikáns depléciója

bekövetkezne (Maggi és mtsai, 1987). A deszenzitizáció ezen általunk is vizsgált korai szakasza más mechanizmusokhoz kapcsolódik és nem magyarázható a capsaicin alkalmazása után közvetlenül kialakuló kezdeti C-rost vezetési blokkal (Waddell and Lav. son., 1989), hiszen érdekes módon az egyes szenzoros neuropeptidekre gyakoioit hatás tekintetében a capsaicin és RTX esetében egyaránt 100-szoros koncentrációkülönbség adódott. A jelenség mechanizmusa

további intracelluláris folyamatok, pl. másodlagosan a feszültségfüggő Ca: csatornák inaktivációja (Xxxxx és Xxxxxxxxxx, 1990) és más ma még nem tisztázott mechanizmusok játszhatnak szerepet. Ebben a szakaszban az efferens válasz hiánya tehát inkább valamiféle excitációs-szekréciós hibának, illetve szétkapcsolásnak tulajdonítható, mint a transzmitter depléciónak. A capsaicin alkalmazása után később a szenzoros neuropeptidek szintézise is csökken és mind in vitro mind in vivo a szenzoros neuropeptidek depléciója is létrejön az idegvégződésekben. Később degeneratív ultrastruktúrális elváltozások is megfigyelhetők (Xxxxxxxxxx es mtsai, W/5, jdiicso es nusai, ívö 4j leiienetoieg a Na - es va -íontODDiet intraneuronális akkumulációja következteben (Bevan és Xxxxxxxxxx, 1990).

A capsaicin-érzékeny szenzoros rostok szelektív inaktivációja, vagyis deszenzitizációja olyan fájdalmas állapotok, vizeletürítési zavarok, illetve gyulladásos betegségek (arthritis, asthma, psoriasis) kezelése esetén lehet hatásos, amelyek tüneteiben a capsaicin-érzékeny rostok fokozott aktivációja szerepet játszik. Jelenleg a klinikumban capsaicin deszenzitizáló hatását intravesicálisan alkalmazva az urológiában detrusor hyperreflexia, hyperreaktív, illetve hyperszenzitív hólyag esetén hasznosítják (Ishizuka, 1995).

a szenzoros neuropeptid felszabadulás mérése alapján a capsaicin receptoron ható agonista és moduláló-antagonista farmakológiai hatások követésére a plazma szomatosztatin és CGRP szintek változását monitorozva.

Az új in vivő modell lehetőséget teremtett, hogy megvizsgáljuk az elmúlt évben az érdeklődés középpontjába került endogén cannabinoid ligand anandamid hatását a szenzoros

cannabinoid, a CB1 receptor ligandja, mely elsősorban központi, valamint perifériás idegrendszeri struktúrákon található és aktivációja az adenil-cikláz, valamint a feszültsegfuggő Ca2" csatornák gátlásához és inward KŐ áramok aktiválódásához vezet (DiMarzo és mtsai, 1998). Az elmúlt év kísérleti eredményei igazoltak, hogy az olvanil, mint vanilloid capsaicin analóg képes az anandamid membrántranszportját gátolni (Xxxxxxxx és Piomelli, 1999). Az anandamid izolált artérián capsazepinnel blokkolható vazodilatációt hoz létre CGRP felszabadításán keresztül a capsaicin-érzékeny afterenseken hatva (Zygmunt és mtsai, 1999).

sikerült igazolni az anandamid izgató hatását a VR1 receptoron (Xxxxxxx és mtsai, 1999, Smart és mtsai, 2000). Ugyanakkor ismeretes, hogy az anandamid anti-nociceptív és perifériás anti-inflammátoros hatását a capsaicin-érzékeny primer afferenseken lévő CB 1 receptoron fejti ki, melynek aktiválása a neurotranszmitter felszabadulás gátlását eredményezi a perifériás, illetve a centrális idegvégződéseken (Richardson és mtsai, 1998). Bár bizonyított, hogy egyes endogén kémiai (protonok), illetve fizikai (forró) ingerek képesek aktiválni a capsaicin receptorát, mind a mai napig nem tudunk a capsaicin VR1 receptort aktiváló endogén kémiai vegyületről. Ezért érthető, hogy a fenti adatok alapján élénk vita bontakozott ki arról, hogy az anandamid a cannabinoid receptor mellett a capsaicin receptor endogén ligandjaként is szerepelhet-e (Xxxxxxxxxx 2000a,b, Xxxxxxx és mstai, 2000, Smart 2000).

A fent említett tények ismeretében vizsgáltuk meg azt, hogyan befolyásolja az anandamid a capsaicin-érzékeny idegek perifériás végződéseiből történő bazális, valamint az ingerléssel kiváltott neuropeptid felszabadulást in vivo modellünkben, illetve in vitro körülmények között

Megvizsgáltuk továbbá az elmúlt években felfedezett nociceptin (Meunier és mtsai, 1995) hatását a szenzoros neuropeptidek RTX által kiváltott felszabadulására in vivo körülmények között. E vegyület nagy fokú szerkezeti hasonlóságot mutat az opioid peptidekkel, funkcionálisan azonban több szempontból eltérően viselkedik Neve intracerebrovascularis adás esetén kiváltott nociceptív hatására vezethető vissza. Érdekessége,

hogy receptorát már a ligand azonosítása előtt felfedezték, azt ,,orphan” azaz árva receptornak, később ORL[ vagyis ,,opioid receptor like l”-nek elnevezve (Xxxxxxxxxx és mtsai, 1995). A nociceptin előzetes kísérleteinkben gátolta in vitro körülmények között a szenzoros neuropeptid felszabadulást (Helyes és mtsai, 1997), valamint in vivő kísérletekben a neurogén gyulladásos folyamatokat, illetve a hízósejtek degranuiaciojat (Nemeth es mtsai, 1998b).

Korábbi összehasonlító vizsgálatok igazolták, hogy az anandamiddal szerkezeti homológiát mutató undecenyl-2-amino-ethanol képes enyhe izgató hatast kifejteni bizonyos fájdalomtesztekben, a capsaicinhez hasonlóan csökkenti a testhőmérsékletet és kiváltja a pulmonális chemoreflexet a capsaicin-érzékeny idegvégződések izgatása révén (Szolcsányi és Xxxxxx-Xxxxx, 1975, Xxxxxxxxxx 1982). Elemeztük az undecenyl-2-amino-ethanol hatását is a plazma szomatosztatin és CGRP szintre, összevetve az RTX esetén tapasztalt izgató hatással.

Módszerek

1. CGRP és szomatosztatin felszabadulás vizsgálata in vivo

Kísérleteinket 200-240 g súlyú nőstény Wistar patkányokon végeztük, amelyeket natrium thiopethallai (Trapanal, 100 mg/kg, i.p.) altattunk. A bal vena jugularist, valamint a jobb artéria carotist megkanüláltuk, a vénás anyagbeadás, illetve artériás vérmintanyerés céljából. Az állatoknak tracheakanúlt kötöttünk be és azokban az esetekben, amelyekben az RTX beadása után átmeneti légzésleállás következett be, rövid ideig mesterséges lélegeztetést alkalmaztunk.

1. Az RTX hatását több dózisban is megvizsgáltuk (0.1, 0.3, 0.6, 1 és 3 pg/kg, i.v.) beadása után 5, illetve 60 perc elteltével artériás vérmintákat vettünk (3 ml/patkány) majd a plazma szomatosztatin és CGRP szinteket RIA-val meghatároztuk (n=5-6/csoport).

2. Kiválasztva az RTX 5 perces dózis-hatás görbéjéről a 0.6 pg/kg-os dózist mely megközelítőleg az ED;o értéknek felelt meg, megvizsgáltuk az RTX adása előtt 5 perccel adott endogén cannabinoid anandamid (10 és 100 pg/kg, i.v.) hatását is. Az anandamid nagyobb dózisánál, mely már szignifikáns gátlást eredményezett mindkét peptid esetén a szelektív CB1 antagonista (SR141716A) hatását is elemeztük. .Az SR141716A előkezelés (100 pg/kg, i.v.)

10 perccel az anandamid (100 pg/kg, i.v.) adás előtt történt. Vizsgáltuk az anandamid (1 mg/kg és 100 pg/kg, i.v.) hatását önmagában a bazális plazmaszintekre is (n=6/csoport).

3. Hasonló idöparaméterekkel megvizsgáltuk a szisztémásán alkalmazott nociceptin (20

hogy receptorát mar a ligand azonosítása előtt felfedeztek, azt orphan” azaz árva receptornak, később ORLi vagyis „opioid receptor like l”-nek elnevezve (Reinscheid és mtsai, 1995). A nociceptin előzetes kísérleteinkben gátolta in vitro körülmények között a szenzoros neuropeptid felszabadulást (Helyes és mtsai, 1997), valamint in vivo kísérletekben a neurogén gyulladásos folyamatokat, illetve a hízósejtek degranuíációjat (Nemeth es mtsai, 1998b).

Korábbi összehasonlító vizsgálatok igazolták, hogy az anandamiddal szerkezeti homológiát mutató undecenyi-2-amino-ethanoi kepes enyhe izgató hatást kifejteni bizonyos fájdalomtesztekben, a capsaicinhez hasonlóan csökkenti a testhőmérsékletet és kiváltja a pulmonális chemoreflexet a capsaicin-érzékeny idegvégződések izgatása révén (Szolcsányi és Xxxxxx-Xxxxx, 1975, Xxxxxxxxxx 1982). Elemeztük az undecenyl-2-amino-ethanol hatását is a plazma szomatosztatin és CGRP szintre, összevetve az RTX esetén tapasztalt izgató hatással.

Módszerek

1. CGRP és szomatosztatin felszabadulás vizsgálata in vivo

Kísérleteinket 200-240 g súlyú nőstény Wistar patkányokon végeztük, amelyeket natrium thiopethallai (Trapanal, 100 mg/kg, i.p.) altattunk. A bal vena jugularist, valamint a jobb artéria carotist megkanüláltuk, a vénás anyagbeadás, illetve artériás vérmintanyerés céljából. Az állatoknak tracheakanült kötöttünk be és azokban az esetekben, amelyekben az RTX beadása után átmeneti légzésleállás következett be, rövid ideig mesterséges lélegeztetést alkalmaztunk.

1. Az RTX hatását több dózisban is megvizsgáltuk (0.1, 0.3, 0.6, 1 és 3 gg/kg, i.v.) beadása után 5, illetve 60 perc elteltével artériás vérmintákat vettünk (3 ml/patkány) majd a plazma szomatosztatin és CGRP szinteket RIA-val meghatároztuk (n=5-6/csoport).

2. Kiválasztva az RTX 5 perces dózis-hatás görbéjéről a 0.6 gg/kg-os dózist mely megközelítőleg az ED50 értéknek felelt meg, megvizsgáltuk az RTX adása előtt 5 perccel adott endogén cannabinoid anandamid (10 és 100 gg/kg, i.v.) hatását is. Az anandamid nagyobb dózisánál, mely már szignifikáns gátlást eredményezett mindkét pepiid esetén a szelektív CB1 antagonista (SR 141716A) hatását is elemeztük. Az SR141716A előkezelés (100 gg/kg, i.v.)

10 perccel az anandamid (100 gg/kg, i.v.) adás előtt történt. Vizsgáltuk az anandamid (1 mg/kg és 100 gg/kg, i.v.) hatását önmagában a bazális plazmaszintekre is (n=6/csoport).

3. Hasonló időparaméterekkel megvizsgáltuk a szisztémásán alkalmazott nociceptin (20

jag/kg, i.p.) azon dózisát, mely a neurogén plazma extravazációt előző kísérleteinkben szignifikánsan gátolta (n=5/csoport).

4. Elemeztük a capsaicinne! szerkezeti hasonlóságot mutató undeceny! 2 amino ethan (1 mg/'kg, i.v.) hatására bekövetkező plazma CGRP és szomatosziaiin szint változásokat

(n=6).

(átlag±S.E.M.). Statisztikai ertekelesre paratlan Student t-probat használtunk. Statisztikailag szignifikánsnak P<0.05 esetén értékeltük az adatokat (** P<0.01. * P<0.05).

2. Neuropeptid felszabadulás vizsgálata m vitro

Kísérleteinkhez 200-240 g súlyú nőstény Wistar patkányokat natrium pentobarbitallal (Nembutal, 40 mg/kg, i.p.) történt altatásban elvéreztettünk. A tracheákat kimetszés után 37

°C-os oxigenizált (95 % CC és 5 % C 02) Krebs oldattal 60 percen át perfundáltuk (1 ml/perc). Az ataramías ieaiinasa után a Kamrákban ievo oidatot 5 percentsem j-szor lecsereive traRcioxat gyűjtöttünk (ingerlés előtti - ingerelt - ingerlés utáni), (II./1. fejezet).

Az anandamidot a második periódus kezdetétől adtuk a szervfürdőbe 10'5 M koncentrációban önmagában, illetve PTX (100 ng/ml) jelenlétében. Xxxxxxxxx hatását megvizsgáltuk nagyobb koncentrációban alkalmazva is (5xl0-4 M) (n=6 minta /csoport).

A mintákat jégbe hütött csövekbe gyűjtöttük és a frakciók SP, CGRP és szomatosztatin koncentrációit specifikus RIA módszerek segítségével határoztuk meg (Németh és mtsai, 1996, 1998a, 1999). A peptidek mennyiségét fmol/mg egységben, nedves szövetsúlyra vonatkoztatva fejeztük ki. Az eredmények statiszikai értékelése Student-féle páros és páratlan t-teszttel történt (** P<0.01, * P<0.05).

Eredmények

1. A szisztémásán alkalmazott RTX dózisfüggően emeli a plazma szomatosztatin, illetve CGRP szinteket. Az 5 perces értékeknél szignifikáns szomatosziaiin szini emelkedési okozott már a 0.3 (ig/kg dózis, míg a CGRP-nél csak a 0.6 pig/kg. A 0.6 (ig/kg, illetve ennél magasabb dózisoknál még 60 perc eltelte után is emelkedett plazmaszinteket mértünk mindkét pepiid esetén (V/l.a. és b. ábra). A szomatosztatin tehát érzékenyebben reagál, azaz küszöbdózisa alacsonyabb és dózis-hatás görbéje hamarabb éri el a maximumai.

Kontroll	0.3 0.6 1.0	3.0	Kontroll 0.3 0.6 1.0 3.0
	RTX (i.v., pg/kg)		RTX (i.v., pg/kg)

V/l.a és b. ábra. Plazma szomatosztatin és CGRP szintek dózisfliggő változása szisztémás RTX kezelés hatására ( a: 5 perces, b: 60 perces érték).

2. Anandamid (100 pg/kg, i.v.) mindkét peptid RTX-kiváltotta felszabadulását jelentős mértékben gátolta: a szomatosztatint 76.3±3.02 %-kal (P<0.01), a CGRP szint emelkedését

80.1 ±4.56 %-kal (P<0.01) csökkentette. A kisebb dózis (10 pg/kg, i.v.) azonban csak a szomatosztatin esetén ért el szignifikáns mértéket, 48.1±3.24 %-os gátlást kifejtve (P<0.05), a CGRP szint emelkedését csak 18.5±1.71 %-kal csökkentette. Az SR141716A szelektív CB1 antagonistával végzett előkezelés mindkét peptid esetén szignifikáns mértékben kepes volt csökkenteni az anandamid gátló hatását, a szomatosztatin (76.3±3.02 %-ról 42.9±2.36 %-ra. P<0.01), valamint a CGRP (80.1±4.56 %-ról 22.25±1.64 %-ra, P<0.01) felszabadulására is, azonban teljesen kivédeni nem tudta (V/2.a. es b. abra).

Önmagában alkalmazva az anandamid nagyobb dózisa (1 mg/kg, i.v.) a szomatosztatin bazális plazmaszintjét szignifikáns mértékben csökkentette a kontrolihoz képest (5.02±0.56-ról 3.52±0.16-re, fmol/ml) (P<0.05), a CGRP esetén azonban nem tapasztaltunk szignifikáns eltérést (17.5±0.78, illetve 18.0±0.59 fmol/ml).

\72.b. ábra. Anandamid hatása intravénás RTX kezeléssel kiváltott CGRP felszabadulásra in vivo.

SP (fmoi/mg)

SOM (finol/mg)

PTX

CGRP (fniol/nig)

V/3. Xxxxxxxxx hatása a szenzoros neuropeptidek felszabadulására />? vitrc

3. Anandamid (10 5 M) m vitro körülmények között mindhárom neuropeptid bazalis felszabadulását szignifikáns mértékben csökkentette, melyet PTX a G-protein út gátlásán keresztül helyreállított. Ez arra utal, hogy az anandamid ezt a hatását a G-protein függő CB1 receptoron és nem direkt ioncsatornákon fejti ki (V/5 ábra) Ezzel szemben nagy koncentrációban alkalmazva (5xi0'4 M) az anandamid igen jeientős neuropeptid felszabadulást eredményezett, ez körülbelül a 1CT5 M capsaicin felszabadító hatásának felelt meg. ami már neurotoxicitásra utal.

4. Nociceptin (20 pg/kg, i.p.) szignifikáns mértékben 46.8±3.8 %-kal (P<0.05) gátolta az RTX-kiváltotta szomatosztatin felszabadulását, míg a CGRP esetén 38.5n3.4 %-os gátlást tapasztaltunk. Az alkalmazott dózisban a nociceptin önmagában nem befolyásolta a bazális peptidszinteket.

5. Undecenyl-2-amino-ethanol (1 mg/kg, i.v.) a CGRP szintet nem befolyásolta,

azonban szignifikáns emelkedést váltott ki a plazma szomatosztatin szintben (5.02±0.56-rol

dózisának, ami arra utal, hogy az RTX közel 3000-szer hatásosabb a szomatosztatin felszabadítás tekintetében.

Következtetések

Kísérleteinkben in vivo körülmények között is igazoltuk a szisztémásán alkalmazott RTX akut izgató hatását a capsaicin-érzékeny idegvégződések VR1 receptorain, ami az intravénás adásból eredően feltehetőleg elsősorban a perivascularis chemonociceptorokon es a polymodális nociceptorokon érvényesül. Az aktiváció hatására felszabaduló peptidek a szisztémás keringésbe is bejutva a plazma CGRP, illetve szomatosztatin szint jelentős, dózisfüggö emelkedését okozzák. A kidolgozott módszer alkalmas in vivo modell a capsaicin receptoron ható agonista, illetve antagonista vegyületek szenzoros neuropeptid felszabadulásra kifejtett hatásának vizsgálatára a plazma neuropeptid szintjeinek követésén keresztül.

A szomatosztatin felszabadulást kiváltó küszöbdózis alacsonyabb, 0.3 pg/kg és a maximális hatás a plazma szint 22 2-szeres emelkedését eredményezte, ezzel szemben a CGRP felszabadulást kiváltó RTX küszöbdózis 0.6 pg/kg és a maximális emelkedés csekélyebb, 5.2- szeres volt. A tartósan (60 perc) fennmaradó hatás az RTX receptorkinetikájából eredő elhúzódó, folyamatos peptidfelszabaditas következménye, tekintettel arra, hogy mindkét peptid féléletideje rövid (szomatosztatin 0.5-3 perc, CGRP 18-20 perc) (Xxxxx és Xxxxxxxx, 1995,

XxXxxx és mtsai, 1988). Irodalmi adatok is bizonyítják, hogy míg a capsaicinncl kiváltott áramok az ingeranyag elvonása után rögtön megszűnnek, ezzel szemben az RTX által kiváltott ionáramválaszok sokkal tartósabbak és még az agonista elvonása után is sokáig fennmaradnak (Xxx és Xxxxx, 1994), ezzel a hosszantartó neuropeptid felszabadító hatás is magyarázható.

Anandamid es nociceptin. gátló hatást fejtenek ki a capsaicin-érzékenv afferensekhöl kémiai ingerrel kiváltott neuropeptid felszabadulásra Anandamid neuropeptid felszabadulásra kifejtett gátló hatása specifikus CB1 antagonistával kivédhető volt in vivo, ami arra utal, hogy az anandamid ezt a hatását a primer afferenseken lévő CB1 receptorok aktiválása útján fejtette ki. Ugyanezt igazolja a PTX-előkezelés eredménye is in vara, mely a gátló hatast kivédte es a bazális peptidszinteket helyreállította. Nem lett volna meglepő eredmény az sem, ha a CB 1 receptorok blokkolása után, anandamid hatására a peptidfelszabadulás fokozódik. Bizonyított, hogy az anandamid képes mindkét receptort, a CB1 és a VR1 receptort is aktiválni, egymást ellensúlyozó hatásokat kiváltva. Irodalmi adatok szerint az anandamid in vitro körülmények

mtsai, 1999), míg in vivo kísérletekben a capsaicin-kiváltotta CGRP felszabadulást a talpba adott 10'10 M koncentrációban gátolta, a bazális felszabadulás befolyásolása nélkül (Xxxxxxxxxx és mtsai, 1998). Ezek alapján feltételezhető, hogy az ananadamid capsaicin VR1 receptor aktiváló hatása a CB1 receptorokon kifejtett gátló hatás következtében nem tud manifesztálódni, ezért az anandamid capsaicin VR1 receptor endogén ligandjaként való funkciója nem látszik elfogadhatónak. In vitro kísérletünkben alkalmazott fiziológiásán nem releváns nagyobb koncentrációval (5xl0"4 M) kiváltott peptidfelszabadulás lehet, hogy a VR1 receptor izgatás eredménye, de ilyen dózistartományban már neurotoxikus hatás sem zárható ki.

A nociceptin szintén gátolta a capsaicin-érzékeny afferensekből kémiai ingerrel kiváltott neuropeptid felszabadulást, feltehetőleg az idegvégződéseken elhelyezkedő ORL1 receptor aktiválása útján. Ebben a nociceptin eltér az opioid vegyületektől, mivel a klasszikus ja és 5 receptor agonisták csak az elektromos stimulációval kiváltott peptidfelszabadulást gátolják (Maggi 1995). Irodalmi adatok szerint a nociceptin gátolja az alacsony feszültségű, T-típusú Ca + csatornák működését (Xxxxxx és mtsai, 1996), valószínűleg ezzel a mechanizmussal gátolva az idegvégződésekből stimuláció hatására történő neuropeptid felszabadulást is.

LEGFONTOSABB ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA

1. Patkányban a szomatoszenzoros idegekhez hasonlóan, a n. vagusok capsaicin- érzékeny szenzoros rostjainak antidrómos ingerlése az aktivált idegvégzödésekből felszabaduló szomatosztatin által közvetített szisztémás gyulladásgátló hatást hoz létre patkányban. Hasonló endogén gyuiladásgátlo hatás váltható ki tengerimalacban a n. íschiadicus szomatoszenzoros idegvégződéseinck ingerlésével.

2. A capsaicin-erzekeny idegvégződések antidrómos, valamint orthodrómos aktivációjával felszabadított szomatosztatin anti-nociceptív hatást is kivált.

3. Kísérletes diabeteses neuropathiában SP, valamint CGRP csökkent felszabadulása mellett igazoltuk a capsaicin-érzékeny szenzoros rostokból a szomatosztatin felszabadulás csökkenését, valamint az így kiváltott endogén gyulladásgátló hatás károsodását is.

4. TT-232 heptapeptid szomatosztatin analóg vegyidet gyulladásgátló hatást fejt ki akut neurogén gyulladásos, valamint krónikus ízületi gyulladásos folyamatokra egyaránt, hatását

idegvégződések sstl, illetve sst4 receptorain. TT-232 gátolta a carrageenin gyulladás leukocyta akkumulációs fázisát is. Hasonló gátló hatással rendelkezett az antidrómos idegingerléssel felszabadított endogén szomatosztatin is. Ingerléssel felszabadított endogén neuropeptidekkel (SP, CGRP) azonban nem sikerült leukocyta akkumulációt kiváltanunk a bőrben.

5. Capsaicin, RTX és piperin, illetve elektromos téringerlés a capsaicin-érzékeny idegvégződésekben tárolt szomatosztatin, CGRP, valamint SP felszabadulását váltják ki koncentráció-, illetve impulzusszámfüggő módon. Az elektromos ingerléssel előidézett peptidfelszabadulás 0.5-10 Hz frekvenciatartományban azonos impulzusszám esetén azonos mértékű. RTX-szel, valamint capsaicinnel kiváltott akut deszenzitizáció szintén koncentrációfüggő és képes kivédeni mind az elektromos téringerlés-, mind a capsaicin- kiváltotta neuropeptid felszabadulást. Mindkét anyag után kialakuló deszenzitizáció legalacsonyabb koncentrációban csak a CGRP felszabadulást gátolja, majd a szomatosztatinét és végül legnagyobb koncentrációban az SP-ét.

6. Szisztémásán alkalmazott RTX a capsaicin-érzékeny chemonocicentorak izgatásával a plazma szomatosztatin és CGRP szint dózisfüggő, rapid, de hosszantartó emelkedését váltja ki. Az így kiváltott neuropeptid felszabadulást az anandamid és a nociceptin gátolja. In vivo neuropeptid felszabadulás alapján kapott eredményeink tehát nem támogatják azt a koncepciót, mely szerint az anandamid a capsaicin VR1 receptor funkcionális hatásokért felelős endogén ligandja lenne.

HIVATKOZOTT KÖZLEMÉNYEK JEGYZEKE

Xxxxxxxx, X., Xxxxxx, M„ Xxx, S.. Xx, X., Xxxxxxxx. I I S. and Xxxxxxx, C. (1998). Discover of a novel non-peptide somatostatin agonist with SST4 selectivity. J Am. Chem. Soc.. 120. 1368-Í373.

Ács. G.. Xxxx, X., Ács. P., Modarrcs. S. and Xxxxxxxx. P M. (1997). Differential activation and desensitization of sensory neurons by resiniferatoxin. J. Neurosci.. 17, 5622-5628.

Xxxxx, P , Xxxxxxxx, C , Xxxxxxxx, P , XxXxxxxx, X X,, Xxxxx, J.A., (1995). NK, receptors mediate leukocy te adhesion in neurogenic inflammation in the rat trachea. Am. J. Physio!. 12, L263-L269

Xxxxxxx, X.X. (1901). On the origin from the spinal cord of the vaso-dilator fibres of the hindlimb, and on the nature of these fibres. J. Physiol., 26, 173-180.

Xxxxxxxx, X. and Xxxxxxxx, D. (1999). Anandamide transport inhibition by the vanilloid agonist olvanil. Pur. J. Pharmacol., 364, 75-78.

Xxxxxxx, X.X., Xxxxxxx, N.E., Xxxxxx. L.T.. Brain. X.X. xxx Xxxxxxxxx, D.R. (1998). Neurogenic cutaneous vasodilation and plasma extravasation m diabetic rats: effect of insulin and nerve growth factor. Rr. J. Pharmacol., 124, 1573-1579.

Xxxxx, X. and Xxxxxxxxxx, X. (1990). Sensory neuron-specific actions of capsaicin: mechanisms and applications. Trends Pharmacol.Sci.. 11,330-333.

Xxxxxxxx, P.M., Xxxxxxxx, X. and Ács, G. (1993). Resiniferatoxin - an ultrapotent capsaicin analogue. In Capsaicin in the Study of Pam. J.N. Wood. (Ed), pp. 45-62. Academic Press, London.

Brain, S.D. (1996). Sensory neuropeptides in the skin. In Neurogenic Inflammation. Geppetti. P. and Xxxxxx, P. (Eds.), pp. 229-244. CRC Press, Boca Raton. FL.

Xxxxxxxx. M.J., Xxxxxxxxxx, M.A., Xxxxxxxx. X., Xxxxx, T.A., Xxxxxx, J.D. and Xxxxxx. D. (1997). The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature, 389. 816-824.

Xxxxxxxx. M.J.. Xxxxxxx, X., Xxxxxxxx, X.X., Xxxxxx. W.J.. Trafton. J.. Petersen-Zeitz, K.R.. Xxxxxxxxxxx, M., Basbaum. A.I. and Xxxxxx. D. (2000). Impaired nociception and pain sensation in mice lacking the capsaicin receptor. Science, 288. 306-3 13.

Xxxxxxxxx, X. (1991). Somatostatin and chronic pain management. In Contemporary Issues in chronic Pain management, Xxxxxx, W.C.V. (Ed), pp. 87-96. Kluwer Academic Publishers, Boston. MA.

Xxxxxxxxx, X.X.X. and Xxxxxxxxx, H.M. (1984). Afferent vagal C fibre innervation of the lung and airways and its functional significance. Rev. Physiol, timehem. Pharmacol.. 99, 1-110.

Xxxxxx,M , Xxx, A and Xxxxxxxxx. G (1996). The effect of nociceptin on Ca:* channel current and intracellular Ca" in the SH-SY5Y human neuroblastoma cell line. Br. J. Pharmacol., 118. 205-207.

Xxxxxxxxx, X.X. (1988). The sensory' system. In Handbook of Chemical Neuroanatomy. Björklund. X., Xxxxxxx, X. and Xxxxx, C. (Eds), pp. 599-636. Elsevier Science publishers B.V.

Xxxxx, J.B., Xxxx, X., Xxxxxxxxx. J.. et ai. (2U0U) Vanilloid receptor-1 is essential for inflammatory thermal hyperalgesia. Nature, 405, 183-187.

DeRose, V., Robbins. R.A.. Snider. R.M.. Spurzem. JR . Thiele. G M . Rennard. S I and Xxxxxxxxxx.

]339-1 346

Xxxxxx, X.X.. Hanus. L . Breuer. A.. Pertwee. R.G.. Xxxxxxxxx. L A Griffin. G . Gibson. D Mandelbaum. A. Etinger. A and Mechoulam. R. (!QQ2). Isolation and structure of of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor. Science. 258. 1946-1949.

Xxxxxx, L.T., Xxxxxxx, E J . Willars. X X , Xxxxxxxxx, DR (1992), Depiction of substance P and calcitonin gene-related peptide in sciatic nerve of rats with experimental diabetes; effects of insulin and aldose reductase inhibition. Neurosci. Lett., i37, 253-256.

Xx Marzo, X., Xxxxx, D., Xxxxxxx, T. and De Pctroccllis, L. (1998). Endocannabinoids: endogenous cannabinoid receptor ligands with neuromodulatory action. Trends Neurosci., 21. 521-528.

Xxxxxxxxx, X.X., Xxxxxx, A.J., XxXxxxx, D.S. and Xxxxx. J.R. (1992). Increased expression of PPT, CGRP but not VIP mRNA in dorsal root ganglia during the development of adjuvant monoarthritis in the rat. Mol. Brain. Res., 16. 143-149.

Donnerer. J.. Schuligoi. R. and Xxxxx. C (1992). Increased content and transport of substance P and calcitonin gene-related peptide in sensors' nerves innervating inflamed tissue: evidence for a regulators'

Fedele. D. and Giugliano.D. (1997). Peripheral diabetic neuropathy. Corrent recommendations and future prospects for its prevention and management. Drugs. 54. 414-421.

Xxxxxx, X.X. and Lam, F.Y. (1996). Sensors' neuropeptides in arthritis. In Neurogenic Inflammation.

Xxxxxxx, X. and Xxxxxx. P. (Eds), pp. 33-42. Boca Raton. U S A.: CRC Press.

Xxxxxxx, W.E., Xxxxxxxxxx. P.. Xxxxx, L.G. and Xxxxxxx, X.X. (1998). Variable effect of streptozotocin diabetes on the growth of hamster pancreatic cancer (H2T) in the Syrian hamster and nude mouse. Surgery, 123, 315-320.

Xxxxx, X. and Xxxxxx. G. (1985). Reduced neurogenic inflammation in streptozotocin-diabetic rats due to microvascular changes but not to substance P depletion. Eur. J. Pharmacol., 118, 175-180.

Xxxxxxx, X. and Xxxxxx, P. (eds.)(1996). Neurogenic Inflammation. Boca Raton. U.S.A.: CRC Press.

Xxxxxx, X., Xxxxxxx, A., Xxxxx, X., Xxxxx, F. and Xxxxxxxx, L. (1996). Effects of streptozotocin-induced diabetes on neurogenic inflammation of gingivomucosal tissue in rat../ Periodontal Res., 3 1. 249-255.

Xxxxxx, Zs., Xxxxxx, X.. Xxxxxx, X. and Xxxxxxxxxx. J. (1997). Inhibition by nociceptin of neurogenic inflammation and the release of SP and CGRP from sensorv nerve terminals. Br. J. Pharmacol., 121, 613-615.

Xxxxx, X.X. xxx Xxxx, K.M. (1988). Immunohistochemical study of neuropeptides in vagal and glossopharyngeal afferent neurons in the rat. Neuroscience. 26, 539-55 1.

Xxxxxxxxx, R.J.A., XxXxxxxxx, L.M.. Xxxxxx, X., Xxxxxx, X., Xxxxx. X. and XxXxxxxx, P. (1998). Capsaicin sensitivity is associated with the expression of the vamlloid (capsaicin) receptor (VR1) mRNA in aduit rat sensors'ganglia. Neurosci. Lett., 250, 177-180.

Xxxxxxx, L.J., Visser-Wissclaar, H.A. and Xxxxxxxx. S.W. (1995). Somatostatin analogs: clinical application in wlatiun to huiiuui somatosiatm receptor subtypes. Biuchem. Pharmacol., 5U, 287-297.

Holzer. P. (1988). Local effector functions of capsaicin-sensitive sensorv nerve endings involvement of tachykinins and other neuropeptides. Neuroscience, 24, 739-768.

Xxxxxx, X. (1998). Neural Injury', Repair, and Adaptation in the Gi Tract. 11. The elusive action of capsaicin on the vagus nerve. Am. J. Physiol., 275/ Gastroiniest. lover Physiol. Shj G8-G13.

Holzer. P. and Xxxxx, C A (1408). Dissociation of dorsal root ganglion neurons into afferent and efferent-like neurons Neuroscience. 86, No. 2, 389-398.

Xxxxxx, X.X. and Xxxxxxxxx. M. (1999). Localization of central cannabinoid CB1 receptor messenger RNA in neuronal subpopulations of rat dorsal root ganglia: a double-label in situ hybridization study. Neuroscience. 90. No 3. 923-93 1.

Xxxxx, X., Xxxxxxx. X. and Xxxxx, X. (1994). Molecular pharmacology of somatostatin receptors.

Xxxxxx Xxxxxxxxxxxx'x Arch. Pharmacol., 350, 441-453.

Hőgycs, X. (1878). Beitrage zur physiologischen Wirkung der Bestandteile des Capsicum annum. Arch. Exp. Path. Pharmac., 9. 117-130.

Xxxxxxxx, X. Xxxxxxxxxx, X. and Xxxxxxxxx. K.E. (1995). Urodynamic effects of intravesical resiniferatoxin and capsaicin in concious rats with and without outflow obstruction. J. Urol, 154, 611- 616.

Xxxxxx, N. (1955). Speicherung. Stoffanreicherung in Retikuloendothel und in der Niere. Budapest: Akadémiai Kiadó.

Xxxxxx, N., Xxxxxx-Xxxxx, A. and Xxxxxxxxxx, X. (1967). Direct evidence for neurogenic inflammation and its prevention by denervation and by pre-treatment with capsaicin. Br. J. Pharmacol., 31, 138-151.

Xxxxxx-Xxxxx, X. and Xxxxxxxxxx, X. (1970). Action of rare earth metal complexes on neurogenic as well as on bradykinin-induced inflammation. J. Pharm. Pharmacol., 22, 366-370.

Xxxxxx, G., Xxxxxx, S., Xxxxxx, X.. Szebeni. X., Xxxx. L., Bácsy. E.. Xxx, X. and Párducz. A (1984) Neurotoxin induced nerve cell degeneration: possible involvement of calcium. Brain. Res., 295, 211- 216.

Xxxxxxx, K., Xxxxxxxxxx, G., Chrousos. G.P. and Xxxxx, X. (1994). Somatostatin analogues suppress the inflammatory reaction in vivo. J. Clin. Invest., 93, 2000-2006.

Kéri, Gy., Mező. I.. Xxxxxx, ZS., Xxxxxxx. A., Xxxx, X.. Vántus. Á.. Balogh. G . Bokónyi, G , Xxxxx, X., Xxxxxx, L, Xxxxx, X., Xxx, M., Xxxxxxx, X. & Xxxxx, X. (1993) Structure-activity relationship studies of novel somatostatin analogs with antitumor activity. Peptide Research, 6, 281-288.

Xxx, Gy., Xxxxxxxx, X., Xxxxxxx, X., Xxxx, L, Xxxx, M„ Vántus. T„ Balogh. Á.. Vadász, Zs., Bökönvi. Gy., Xxxx, X., Xxxxxx, L. Xxxxx, O., Tejeda, M., Xxxx, D., Szegedi. Zs.. Szende. B., Xxxx, C., Xxxxxxxx

H. & Ullrich A. (1996). A tumor-selective somatostatin analog (TT-232) with strong in vitro and in vivo anti-tumor activity. Proc. Natl. Acad Sci USA., 93, 12513-12518.

Xxxxxxxxxx, S.L., Xxxxxx, X., Xxxxxx, E.L. et al. (1992). Neuropetidcs and inflammation. A somatostatin analog as a selective antagonist of neutrophil activation bv substance P Arthritis T Rheumatism 00 000-000

Lawson. S.N. (1996). Peptides and cimuieous polymodal nociceptor neurones, in Progress in Brum Research Kumazawa. T . Kruger. L. Mizumtira. K (Eds ).Vol 113 pp 369-385 Elsevier Amsterdam.

Xxxxxxx, F. and Xxxxxx, P. (1979) Substance P as neurogenic mediator of vasodilatation and neurogenic plasma extravasation. Naunyn Schmiedehergs Arch. Pharmacol.. 310, 175-183.

Xxxxxxx, X.. Donnerer. X. and Xxxxxx. L. (1982). Inhibition of neurogenic vasodilatation by substance P antagonists, somatostatin and (D-met:. pro")cnkephalinamide. Fair. J. Pharmacol., 85, 171-176.

Xxx, X. and Xxxxx, S.A. (1994). A rapid capsaicin-activated current in rat trigeminal ganglion neurons.

Proc. Natl. Acad. Set. Usa, 91, 738-741.

Xxx, X. and Xxxxx, S.A. (1996). Similarities and differences in the currents activated by capsaicin, piperine and zingerone in rat trigeminal ganglion cells. J. Neurophysiol., 76, 1858-1869.

Xxxxxxxx, X.X. (1996). Pharmacology of cotransmission in the autonomic nervous svstem: Integrative aspects on amines, neuropeptides adenosine triphosphate, amino acids and nitric ovidé Pharmacol Rev., 48, 113-178.

Xxxxxxxx, J.M., Xxxxxx, X. and Xxxxx. A. (1983). Effects and distribution of vagal capsaicin-sensitive substance-P neurons with reference to the trachea and lungs, Acta Physiol. Scand., 119. 243-252.

Xxxxx, X.X. (1995). Tachykinins and calcitonin gene-related peptide (CGRP) as co-transmitters released from peripheral endings of sensory nerves. Prog. Neurohiol., 45. 1-98.

Xxxxx, X.X., Xxxxxxxxxx. X., Xxxxxxx, P. Xxxxxxxx, S., Xxxxxxxxxx, R., Xxxxx, S., Grassi, X. and Xxxx, X. (1987). Involvement of peripheral site of action in the early phase of neuropeptide depletion following capsaicin desensitization. Brain. Res.. 436, 402-406.

Xxxxx, C.A. and Xxxx, X. (1988). The sensory-efferent function of capsaicin-sensitive sensory neurons.

Gen. Pharmacol., 19, 1-43.

Xxxxxxx, X., Xxxxxxxxx, X., Xxxx, X., Xxxxxx, X., Xxxxxxxx, Y., 1989. Substance-P induces granulocyte infiltration through degranulation of mast-cells. J. Immunol. 142, 927-931.

XxXxxxxx, X X. (1988). Neurogenic inflammation in the rat trachea. I. Changes in venules, leukocytes and epithelial cells, X. Neurocytol., 17. 583-603.

XxXxxxxx, X.X., Xxxxxxxx. R.A., GabcIIa, G. and Xxxxxxx, X. (1988). Neurogenic inflammation in the rat trachea. II Identity and distribution of nerves mediating the increase in vascular permeability, J. Neurocytol., 17. 605-28.

XxXxxx, X.X., Xxxxxxxx, N., Xxxxxx, S., Xxxxxx, R.W., Xxxxxxx, C.T. and XxXxxxxx, X. (1988). Vasodilatation by calcitonin gene-related peptide and by substance P: a comparison of their effects on resistance and capacitance vessels of human forearms. Circulation, 77, 1072-1080.

McGillis. J.P. and Xxxxxxxxx. S.(19991 Sensnrv neuropeptide';, nenrogenic inflammation and inflammatory cells. In: Pain and Neurogenic Inflammation, eds.: S.D. Brain and P.K. Xxxxx, Xxxxxxxxxx, pp. 115-135.

Mcunier. J.-C.. Mollercau. C.. Toll. L . Suadeau. C , Moisand. C , Alvinerie. P , Butour. X.-X., Xxxxxxxxx, X.-X., Ferrara, P., Xxxxxxxxx, B., Xxxxxxxxx. H.. Vassart. G . Parmentier. M. & Costentin.

J. (1995). Isolation and structure of the endogenous agonist of opioid receptor-like ORL, receptor.

Nature, 377, 532-535.

Moroncy. M.A., Xxxxxxx, M.J., Xxxxxx, R.A., Xxxxx, F„ Hoult, J.R.S. (1988). Selectivity of neutrophil 5-lipoxygenase and cyclo-oxygenase inhibition by an anti-inflammatory flavonoid glvcoside and related aglycone flavonoids. J. Pharm. Pharmacol. 40, 787-792.

Xxxxxx, X., Xxxxxx, Zs., Xxxxx, T., Xxxxx, X., Xxxxxx, X. and Xxxxxxxxxx, X. (1996). Development of somatostatin radioimmunoassay for the measurement of plasma and tissue contents of hormone. Acta Physiologica Hunganca, 84, 313-315.

Xxxxxx, X., Xxxxx, T.. Helves, Zs., Xxxxxx, G.. Xxxxx, X., Xxxxxx, X. and Xxxxxxxxxx, X. (1998a). Development of a new sensitive CGRP radioimmunoassav for neurophamiacological research. Neurobiology, 6, 473-475.

Xxxxxx, X., Xxxxxx, Zs., Oroszi. X., Xxxx, M., Xxxxxx, X. and Xxxxxxxxxx. J. (1998b). Inhibition of nociceptin on sensory neuropeptide release and mast cell-mediated plasma extravasation in rats. Eur. J. Pharmacol., 347, 101-104.

Xxxxx, X., Xxxxx, X. and Xxxxxxx, D.N. (1999). Leukocyte-endothelial cell adhesion: avenues for therapeutic intervention. Br. J. Pharmacol. 126, 537-550.

Xxxxxxxxxx, R., Xxxxx, A., Xxxx, X. (1990) Capsaicin-like activity of some natural pungent substances on peripheral endings of visceral afferents. Xxxxxx Xxxxxxxxxxxx'x Arch. Pharmacol. 342. 72-77.

Xxxxx, Y.C. and Xxxxxxxx, T. (1983). In vivo and in vitro plasma disappearance and metabolism of somatostatin-28 and somatostatin-14 in the rat. Endocrinology, 112. 220-225.

Xxxxx, Y.C. and Xxxxxxxxxx, X. (1985). Cysteamine induces a loss of tissue somatostatin-28 when as somatostatin-280 i_28)-like immunoreactivitv but not when assassed as somatostatin-28(i.|4)-like immunoreactivity: evidence for the importance of the disulfide bond for cvstcamine action. Endocrinology, 116, 1699-1702.

Xxxxx, Y.C., Xxxxxx, K.K., Xxxxxx, E.E., Xxxxxxxx, D., Xxxxxx, X. and Xxxxxx, C.B. (1990). Mechanism of action of somatostatin: an overview of receptor function and studies of the molecular characterization and purification of somatostatin receptor proteins. Metabolism. 39 (Suppl. 2), 63-69.

Pintér. X. and Xxxxxxxxxx, X. (1988). Inflammatory and antiinflammatory effects of antidromic stimulation of the dorsal roots in the rat. Agents Actions. 25. 240-241.

Xxxxxx, X. and Xxxxxxxxxx, X. (1996). Systemic anti-inflammatory effect induced by antidromic stimulation of the dorsal roots in the rat. Neurosci. Lett., 212. 33-36.

Xxxxxx, E„ Helves, Zs., Xxxxxx, X., Xxxxxx, X., and Xxxxxxxxxx, X., (1997), Somatostatin, as anti inflammatory neuromediator: in vivo and in vitro evidence. Naunvn-Schmtedeberg's Arch. Pharmacol., Suppl. 1., 356, R-44.

Xxxxxxx, V., Xxxxx, A., Xxxxxxxxx, G. (1993). Impaired sensory motor nerve function in llic isolated mesenteric arterial bed of streptozotocin-diabetic and ganiíliosid-treated streptozotocin-diabetic rats. Br. ./ Pharmacol. 110. 1105-1111.

Reinschcid. R.K.. Nuthackcr, II.P.. Bourson. A.. Ardati. A.. I Ienninsen. R A . Bunzow. X R , Xxxxxxx, D.K.. Lángén. H.. Xxxxxx, F.J. and Xxxxxxx. 0. (1995). Orphanin FQ. A neuropeptide that activates an opioidlike G protein-coupled receptor. Science, 270, 792-794.

Reisine. T. (1995). Somatostatin. Cellular and molecular Neurobiology. 15. 597-615

Xxxxxxx, T„ He, H„ Rcns-Domiano, S.. Xxxxxx. J.. Xxxxxx, X . Bonslow. S. and Thermos. K. (1990). Biochemical properties of somatostatin receptors. Metabolism, 39, (Suppl. 2.), 70-73.

Xxxxxxxxxx, J.D., Xxxx, X. and Xxxxxxxxxx, K.M. (1998). Cannabinoids reduce hyperalgesia and inflammation via interaction with peripheral CB1 receptors. Xxx, 75, 111-119.

Xxxxxxxxxxx, X., Xxxxxx-Xxxxxxxxx. A.C.. Xxxxxxxx, X. (1990). Improved method for quantification of tissue PMN accumulation measured by myeloperoxidase activity. J. Pharmacol. Methods, 23. 179-186.

Springall. D.R., Xxxxxxx. X., Xxxxxxxx. H.. Su. H.. Royston. D.. Polák. J.M. (1987). Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia.,/ Autón. Nerv. Syst.. 20. 155-166

Strieker, S. (1876). Untersuchung iiber die Geffasserwurzeln des Ischiadicus. Sitz. Kaiserl. Akad. Wiss. (Wien) 3, 173-180.

Xxxxx, D., Xxxxxxxxx, M.J., Xxxxxx, J.C., Xxxxx, S., Xxxx, X., Xxxx. A.I., Xxxxxxxx, J.K.. Xxxxxxx,

A.D. and Xxxxx, J.B. (2000). The endogenous lipid anandamide is a full agonist at the human vanilloid receptor (hVRl). Br. J. Pharmacol.. 129. 227-230.

Xxxxx, C.H., Xxxxxx, J.N., Xxxxxx. X.X., XxXxxxxx, D M. and Xxx. T.H. (1993). Neuropeptides induce rapid expression of endothelial cell adhesion molecules and elicit granulocytic infiltration in human skin. J. Immunol., 151, 3274-3282.

Xxxxx, X. (1995). The control of pain in peripheral tissue by opioids. New England J. Med., 332, 1685- 1690.

Suzuki, X., Xxxxx, X., Xxx. Y.Y., Xxxxxxxx, M., Xxxxx, X. (1995). Substance P induces degranulation of mast cells and leukocyte adhesion to venular endothelium. Peptides, 13, 429-434.

Xxxxxxxx, X. and Xxxxxxxx, P.M. (1989). Resiniferatoxin, a phorbol-related diterpene, acts as an ultrapotent analog of capsaicin, the irritant constituent in red pepper. Neuroscience, 30, 515-520.

Xxxxxxxx, X. and Xxxxxxxx, P.M. (1990). Resiniferatoxin and its analogs provide novel insights into the pharmacology of the vanilloid (capsaicin) receptor Life Set . 47 . 1399-1408

Xxxxxxxx, X. and Xxxxxxxx P.M. (1996). Vanilloid-rcccptors: New insights enhance potential as a therapeuthic target. Xxx, 68, 195-208.

Xxxxxxxx, X. and Xxxxxxxx, P.M. (1999). Vanilloid (Capsaicin) Receptors and Mechanisms.

Pharmacological Rev. 51, 159-211.

Xxxxxxxxxx, X. (1982). Capsaicin type pungent agents producing pyrexia. In Handbook oj'Experimental Pharmacology, cd. Milton. A.S.. Vol. 60.. Xxxxxxxx and Antipyretics, pp. 437-478. Springer-Verlag.

Berlin

capsaicinoids and piperine on the guinea-pig trachea Neurosci Lett.. 42. 83-88.

Xxxxxxxxxx, X. (1984). Capsaicin-sensitive chemoceptive neural system with dual sensory-efferent function. In Antidromic Vasodilatation and Neurogenic Inflammation Chahl. LA . Xxxxxxxxxx. X. and Xxxxxxx, F. (Eds), pp. 27-33. Akadémiai Kiadó. Budapest.

Xxxxxxxxxx, X. (1988). Antidromic vasodilatation and neurogenic inflammation. Agents Actions, 23, 4-

11.

Xxxxxxxxxx, X. (1993). Actions of capsaicin on sensory receptors. In Capsaicin in the Study of Pain.

J.N. Wood. (Ed), pp. 1-26. Academic Press, London.

Xxxxxxxxxx, X. (1996a). Neurogenic inflammation: reevaluation of axon reflex theory. In Neurogenic Inflammation. Gepctti, G. and Xxxxxx. P. (Eds), pp. 33-42. Boca Raton, U.S.A.: CRC Press.

Xxxxxxxxxx, X. (1996b). Capsaicin-sensitive sensory nerve terminals with local and systemic efferent functions' facts and scones of an unorthodox neiirorcgulatorv mechanism In Propress in fírain Research. Kumazawa. T.. Kruger. L. and Xxxxxxxx. K. (Eds), Vol. 113.. pp. 343-359. Elsevier, Amsterdam.

Xxxxxxxxxx, X. (2000a). Are cannabinoids endogenous ligands for the VR1 capsaicin receptor9 Trends Pharmacol. Sci., 21, 41-42.

Xxxxxxxxxx, X. (2000b). Anandamide and the question of its functional role for activation of capsaicin receptors. Trends Pharmacol. Sci., 21, 203-204.

Xxxxxxxxxx, X. and Xxxxxx-Xxxxx. A. (1975). Sensory effects of capsaicin congeners. I. Relationship between chemical structure and pain-producing potency of pungent agents. Arzneimittel- Forschung, 25. 00-000-0000.

Xxxxxxxxxx, X., Xxxxxx-Xxxxx, A. and Xxx, X. (1975). Functional and fine structural characteristics of the sensory neuron blocking effect of capsaicin. Xxxxxx- Xxxxxxxxxxxx'x Arch. Pharmacol., 287, 157- 169.

Xxxxxxxxxx, X., Xxxxxxxx, X., Xxxxxxxx, Z.. Xxx, X. and Xxxxxxxx, P.M. (1990). Resimferatoxin: an ultrapotent selective modulator of capsaicin-sensitive primary afferent neurons. J. Pharmacol. Exp.Ther., 255, 923-928.

Xxxxxxxxxx, X., Helves. Zs., Oroszi. G.. Xxxxxx, X., and Xxxxxx, X. (1998a). Release of somatostatin and its role in the mediation of the anti-inflammatory effect induced bv antidromic stimulation of sensory- fibres of rat sciatic nerve, fír. J Pharmacol., 123, 936-^42.

Xxxxxxxxxx, X., Xxxxxx, X., Xxxxxx, Zs., Oroszi, G. and Xxxxxx. J. (1998b). Systemic anti-inflammatory effect induced by counter-irritation through a local release of somatostatin from nociceptors. Br. J. Pharmacol., 125,916-922.

Xxxxx, F., Undem B. (1995). Exogenous but not endogenous substance P releases histamine from isolated human skin fragments. Neuropeptides, 29, 35 1-355.

Theisen-Ponn P and Müller-Peddinghaus R (1994) Antirheumatic drug profiles evaluated in the adjuvant arhtritis of rats by multiparameter analysis 4 vents Actions 47 50-55

Tominaga. X., Xxxxxxxx. M.j.. Maimberg. A.B.. Rosen. T.A.. Xxxxxxx, X.. Xxxxxxx, X.. Raumann. B E.. Xxxxxxx, A I and Xxxxxx, D (1998) The Cloned Capsaicin receptor Integrates Multiple Pain- Producing Stimuli. Neuron, 21. 531-543.

Xx, X X , Xxx, J X , Xxxxxxxxxx-Xxxxxx. Zs. Hakanson. R . Folkers. K, and Xxxxxxx. T. (1991). Xxxxxxxx XX, a novel tachykinin antagonist, and galanin inhibit plasma extravasation induced by antidromic C- fibre stimulation in rat hindpaw. Neuroscience. 42, 73 1-737.

Xxxxxxxxxx, X., Xxxxxxxxxx, M., Xxxxxxx, B. and LeBars. D. (1986). Ascending pathways in the spinal cord involved in triggering of diffuse noxious inhibitor}' controls (DNIC) in the rat. J. Neurophysiol.. 55, 34-55.

Xxxxxxx, P.J. and Xxxxxx, S.N. (1989). The C-fibre conduction block caused by capsaicin on rat vagus nerve in vitro. Pain. 39. 237-242.

Wallace. J.L.. McKnight. W.. Miyasaka. M. et al.(1993). Role of endothelial adhesion molecules in NSAID-induced gastric mucosal injur}'. Am. J. Physiol. 265. G993-G998.

Xxxxxxxx, X. and Xxxxx, P.G. (1991). Early loss of neurogenic inflammation in the human diabetic foot. Clin. Sci. Colch., 80. 605-610.

Xxxxxx, X., (1998). Brain derived neurotrophic factor, but not nerve growth factor, regulates capsaicin sensitivity of rat vagal ganglion neurones. Neurosci. Lett. 241, 21-24.

Xxxxxxx, M.P.. Xxxxxxxxx, X., Xxxxxxxxx. D.A.. Xxxxxx, X.. Sorgard. M.. XxXxxxx ,X., Xxxxxx. X. and Xxxxxxxxx, E.D. (1999). Vanilloid receptors on sensor.' nerves mediate the vasodilatator action of anandamide. Nature. 400, 452-457

Xxxxxxx, P.M., Xxxxxx, D., XxXxxxx, V. & Xxxxxxxxx, E.D. (2000). Anandamide-the other side of the coin. Trends Pharmacol. Sci., 21. 43-44,

k ö s z ö n e t n y i l v á n í t á s

Ezúton szeretnék köszönetét mondani mindazoknak, akik támogatásukkal segítették, hogy ez a doktori értekezés elkészüljön. Mindenekelőtt Prof. Szo/xxxxxx Xxxxxxxx, témavezetőmnek hogy bevezetett a neurofarmakologia vilagaba, es kutatómunkámat logikus gondolkodásával es konstruktív kritikáival mindvégig irányította Ugyancsak köszönettel tartozom munkatársaimnak: Xx. Xxxxxx Xxxxxxxxx, Xx. Xxxxxx Xxxxxxxx, Dr. Xxxxxxxx Xxxxxxxxx cs Dr. Xxxxxx Xxxxxxxxxxxx a kísérletek elvégzésében és eredményeink közlésében való közreműködésükért, barátságukért. Asszisztensnőinknek, Xxxxx Xxxxxxxx Xxxxxxxxx cs Xxxxxxxxx Xxxxxxxx Marának köszönöm gondos, megbízható, készséges segítségüket és a Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet valamennyi dolgozójának, hogy kiegyensúlyozott, nyugodt munkahelyi légkört biztosítottak számomra. Végül köszönettel tartozom családomnak, elsősorban szüleimnek, türelmükért, megértésükért es hasznos tanácsaikért,

PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE

A./ Nemzetközi folyóiratok

1. Xxxxxx X., Xxxxxx Zs., Oroszi G., Xxxx M., Xxxxxx X., Xxxxxxxxxx J.: Inhibition of nociceptin on sensory neuropeptide release and mast cell-mediated plasma extiavasation in

Eur. J. Pharmacoi., 347, 101-104, 1998.

2. Xxxxxx X., Xxxxxxxxx Z., Xxxx M., Oroszi G., Xxxx X., Xxxxxxxxxx J.: Decreased sensory neuropeptide release from trachea of the rat with streptozotocin-induced diabetes.

Eur. J. Pharmacol., 369, 221-224, 1999.

3. Xxxxxx J., Xxxx M., Xxxx R., Xxxxx B., Oroszi G., Xxxxxx B., Xxxxxxxxxx X., Xxxxxxxxx Z.: Impairment of neurogenic inflammatory and anti-inflammatory responses in diabetic rats.

Eur. J. Pharmacol., 386, 83-88, 1999.

4. Xxxxxx Zs., Xxxx M., Oroszi G., Xxxxxx E., Xxxxxx J., Xxxx Xx., Xxxxxxxxxx J.: Anti nociceptive effect induced by somatostatin reieased from sensory nerve terminals aim uy synthetic somatostatin analogs in the rat.

Neurosci. Lett., 278, 185-188, 2000.

5. Xxxx M., Xxxxxx X., Xxxxxxxxx Z., Xxxxxx E., Xxxxxx Zs., Xxxxxxxxxx J.: Anti-inflammatory effect of somatostatin released from capsaicin-sensitive vagal and sciatic sensory fibres of the rat and guinea-pig.

Eur. J. Pharmacol., (közlésre elfogadva) 2000.

6. Xxxxxx, X., Xxxx, X., Xxxxxxxxxx, X.: Xxxxxxxxxx induced inhibition on the release of CGRP and somatostatin evoked by resiniferatoxin in the rat in vivo.

Brit. J. Pharmacol., (közlésre benyújtva) 2000. B7 Angol nyelvű hazai folyóiratok

1. Xxxxxx X., Oroszi G., Xxxx M., Xxxxxx Zs., Xxxxxx E„ Xxxxxx X., Xxxxxxxxxx J.: Substance P radioimmunoassay for quantitative characterization of sensory neurotransmitter release. Neurobiology, 7, 437-444, 1999.

II. Fo l y ó ir a t o k ba n ml u je l l n t h l ü a d á sk iv ü n a iu k .

A./ Külföldi folyóiratok, kongresszusi kiadványok

1. Xxxxxxxxxx X., Xxxxxx X., Xxxxxx Zs., Xxxxxx J., Oroszi G., Xxxx M., Kéri Gy.: Anti inflammatory effect induced by TT-232, a novel heptapeptide somatostatin analog.

Regül. Peptides, 80, 137, 19^9

2. Xxxx M., Xxxxxx X., Xxxxxx Zs., Xxxxxxxxx Z., Xxxxxx X., Xxxxxxxxxx J.: Somatostatin stimulation.

Regül. Peptides, 80. 137. 1999,

3. Xxxx M., Xxxxxx X., Xxxxxxxxx Z., Xxxxxx G., Xxxxxxxxxx J.: Systemic anti-inflammatory effect mediated by somatostatin released from activated sensory vagal nerve terminals in rats and guinea-pigs.

Fundam. Clin. Pharmacol., 13, 328s, 1990.

4. Xxxxxx X., Xxxxxx Zs., Xxxxxx J., Oroszi G., Xxxx M., Xxxx Xx., Xxxxxxxxxx J.: Pharmacological analysis of the anti-inflammatory effect induced by TT-232, a novel heptapeptide somatostatin analog.

Fundam. Clin. Pharmacol., 13, 36s, 1999.

5. Than M., Xxxxxx E., Brain S.D., Xxxxxxxxxx X., Xxxxxxxxxx J.: Local and systemic effect of sciatic nerve stimulation on cutaneous neutrophil accumulation in the rat hindpaw.

Regül. Peptides, 89, 84, 2000.

6. Xxxxxx J., Xxxx M., Xxxxx B , Oroszi G., Xxxxxxxxxx X., Xxxxxxxxx Z : Impaired anti inflammatory response and decreased sensory neuropeptide release in streptozotocin-induced diabetes.

J. Physiol. London, (közlésre elfogadva) 2000.

B./ Angol nyelvű hazai folyóiratok

1. Xxxx X., Xxxxxx X., Xxxxxxxxx Z., Xxxxxx G., Xxxxxxxxxx J.: Role of circulating somatostatin of neural origin in the development of systemic anti-inflammatory effect induced by local neurogenic inflammation in rats and guinea-pigs.

Neurobiology, 7, 397, 1999.

2. Xxxxxx X., Xxxx M., Xxxxxx Zs., Oroszi G., Xxxxxx X., Xxxxxxxxxx J.: Substance P radioimmunoassay for quantitative characterization of sensory neurotransmitter release. Neurobiology, 7, 360, 1999.

3. Xxxx M., Xxxxxx X., Xxxxxx Zs., Oroszi G., Xxxxxx E., Xxxxxxxxxx J.: Release of somatostatin and CGRP from capsaicin-sensitive sensory' nerve terminals in vitro and in vivo. Neurobiology, (közlésre elfogadva) 2000.

4. Xxxxxx X., Xxxx M., Xxxx R., Xxxxx B., Oroszi G., Xxxxxxxxxx I , Xxxxxxxxx Z.: Impairment of neurogenic inflammation elicited systemic anti-inflammatory response in experimental diabetes. Neurobiology, (közlésre elfogadva) 2000

5. Xxxxxx Zs., Xxxx M., Xxxxxx L, Xxxxxx X., Xxxx Xx., Xxxxxxxxxx 1: Mechanism of the inhibitory effect induced by TT-232 and anandamide on sensory neuropeptide release. Neurobiology, (közlésre elfogadva) 2000.

ELŐADÁSOK ES FŐSZ I KREK LISTÁJA

1. Xxxx M., Xxxxxx J., Oroszi G., Xxxxxxxxx Z., Xxxxxxxxxx J.: Szisztémás gyulladáscsökkentő hatás indukciója a n. vagus capsaicin-érzékeny rostjainak antidrómos ingerlésével

Magyar Élettani Társaság LXIII. Vándorgyűlésé, Debrecen, 1998. julius 8-11.

2. Than M., Oroszi G.: Szisztémás gyulladáscsökkentő hatás kiváltása a n. vagus capsaicin- érzékeny rostjainak antidrómos ingerlésével.

Doktoranduszok II. Országos Konferenciája, Debrecen 1998 augusztus 3ö-.szepiemuei 1.

3. Xxxx M., Xxxxxx X., Xxxxxxxxx Z., Xxxxxx G., Xxxxxxxxxx J.: Role of circulating somatostatin of neural origin in the development of systemic anti-inflammatory effect induced by local neurogenic inflammation in rats and guinea-pigs.

Magyar Idegtudományi Társaság VI. Konferenciája, Harkány-Pécs, 1999. január 27-30.

4. Xxxxxx J., Xxxx X., Xxxxxx Zs., Oroszi G., Xxxxxx X., Xxxxxxxxxx J.: Substance P radioimmunoassay for quantitative characterization of sensory neurotransmitter release. Magyar Idegtudományi Társaság VI. Konferenciája, Harkány-Pécs, 1999. január 27-30.

5. Than M„ Helyes Zs.: A vagus érzőidegvégződéseiből felszabaduló szomatosztatin szisztémás gyuliadasgatlo natasa.

Pécsi Akadémiai Bizottság- Neurobiológiai Munkabizottság, ’’Agykutatás Hete” Pécs, 1999. március 15-21.”

6. Helyes Zs., Than M.: A capsaicin-érzékeny érzőidegvégződésekből felszabaduló mediátor antinociceptív hatása.

Pécsi Akadémiai Bizottság- Neurobiológiai Munkabizottság, ’’Agykutatás Hete” Pécs, 1999. március 15-21.”

7. Xxxxxxxxxx X., Xxxxxx X., Xxxxxx Zs., Xxxxxx J., Oroszi G , Xxxx M., Kéri Gy.: Anti inflammatory effect induced by TT-232, a novel heptapeptide somatostatin analog.

9th Meeting of the European Neuropeptide Club, Ferrara, Olaszország, 12-15 May, 1999.

8. Xxxx M., Xxxxxx X., Xxxxxx Zs., Xxxxxxxxx Z., Xxxxxx X., Xxxxxxxxxx J.: Somatostatin mediated systemic anti-inflammatory effect induced by antidromic vagal and sciatic nerve stimulation.

9th Meeting of the European Neuropeptide Club, Ferrara, Olaszország, 12-15 May, 1999.

9. Xxxx M., Xxxxxx X., Xxxxxxxxx Z., Xxxxxx G., Xxxxxxxxxx J.: Systemic anti-inflammatory effect mediated by somatostatin released from activated sensory vagal nerve terminals in rats and guinea-pigs.

2nd European Congress of Pharmacology, Budapest, Hungary, 3-7 July, 1999

10. Xxxxxx X., Xxxxxx Zs., Xxxxxx J., Oroszi G., Xxxx M., Xxxx Xx., Xxxxxxxxxx J.: Pharmacological analysis of the anti-inflammatory effect induced by TT-232, a novel heptapeptide somatostatin analog.

2nd European Congress of Pharmacology, Budapest, Hungary', 3-7 July, 1999.

11. Xxxx M., Xxxxxx X., Xxxxxxxxx X., Xxxxxxxxxx J.: Xxxxxxxxxx gyulladáscsökkentő hatás

antidrómos ingerlésévei patkányban és tengerimaiacban. Az idegi eredetű somatostatin mediátor szerepe.

Tüdőgyógyászati, Allergológiai es Immunológiai Megbetegedések (TAhVl) Nemzetközi Alapítvány V. Tudományos Konferenciája, Debrecen, 1999. augusztus 26-27. II. díjat nyert pályamunka.

12. xxxxx X., Xxxxxx X., Xxxxxx Zs.. Uroszi O , Xxxxxx h., xxxxxxxxxx J.: Release of somatostatin and CGRP from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in vitro and in vivo. MITT 2000, Magyar Idegtudományi Társaság Konferenciája, Budapest, 2000. január 19-22.

13. Xxxxxx J., Xxxx M., Xxxx R., Xxxxx B., Oroszi G., Xxxxxxxxxx X., Xxxxxxxxx Z.: Impairment of neurogenic inflammation elicited systemic anti-inflammatory response in experimental diabetes.

MITT 2000, Magyar Idegtudományi Társaság Konferenciája, Budapest, 2000. január 19-22.

14. Xxxxxx Zs., Xxxx M., Xxxxxx I , Xxxxxx X., Xxxx Xx., Xxxxxxxxxx J.: Mechanism of the inhibitory effect induced by TT-232 and anandamide on sensory neuropeptide release.

MITT 2000, Magyar Idegtudományi Társaság Konferenciája, Budapest, 2000. január 19-22.

15. Xxxx M., Xxxxxx E., Brain S.D., Xxxxxxxxxxx X., Xxxxxxxxxx J.: Local and systemic effect of sciatic nerve stimulation on cutaneous neutrophil accumulation in the rat hindpaw.

10th Annual Meeting of the European Neuropeptide Club, Innsbruck, Németország, 10-13 May, 2000.

16. Xxxxxx T, Xxxx M., Xxxxx B,, Oroszi G., Xxxxxxxxxx X., Xxxxxxxxx Z.: Impaired anti inflammatory response and decreased sensory neuropeptide release in streptozotocin-induced diabetes.

Joint Meeting of the Physiological Society and the Hungarian Physiological Society, Budapest, Hungary, 27-29 May, 2000.

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ SAJÁT KÖZLEMÉNYEK

ELSEVIER

S y s t e m i c a n t i - i n f l a m m a t o r y e f f e c t o f s o m a t o s t a t in r e l e a s e d f ro m c a p s a i c i n - s e n s i t i v e v a g a l an d s c i a t i c s e n s o r y f ib r e s o f the

rat an d g u i n e a - p i g

\u in a Than '1, Jozsct Xxxxxx X Xxxxxx Xxxxxxxx , Xxxxx Xxxxxx Zmiz .v xxxxx Xxxxxx Z Xxxxx Xxxxxxxxxx J-b-’

The distal

KVA NS BI.KK(fio dye/.; wel

£ r~s

REGULATORY

PEPTIDES

Fundamental

Pharmacology

*Clinical

INCLUDINGTHEFORMERARCHIVESINTERNATIONALESDEPHARMACODYNAMIEETDETHÉRAPIE

VOL 13/Suppl. 1

1999

THE INTERNATIONAL PUBLICATION OF THE FRENCH PHARMACOLOGICAL SOCIET

ELSEVIER

Neuroscience Letters

Anti-nociceptive effect induced by somatostatin released from sensory nerve terminals and by synthetic somatostatin analogues in the xxx

Xxxxxxxxx Xxxxxx0, Xxxxx Xxxxx, G ábor O roszi0, Xxxxx X in té r0, Xxxxxx N em eth 0, G yörgy X xxxx, Xxxxx X xxxxxxxxx0 *

ejp

Short eoiimauiicatie-n

D e c r e a s e d se n s o r y n e u r o p e p t i d e r e l e a s e f r o m t r a c h e a o f rats w i t h s t r e p t o z o t o c i n - in d u c e d d i a b e t e s

Xxxxxx Xxxxxx ' . Xxxxxx X/atvassv \ M artha Ilia n . Oahor uros/.i . Keka San \ Janos S/olesanyi L

í I

J i

study was carried out with 36 male Wistar rats zht/dark periods'a day. temperature of 22-25aC.

,■ of 50-70 'f) with four animals per cage fed

(second group). Iwelve .

l (40 V. 0.1 ms. 10 Hz for 120 s

i from 200-|jl 1 samples of organ fluid of the p

Helyes et ah. 1997). The u repeated with separate prep 6 animals per group) preinc

3.2. Field

4.4 ± 0.6 mmol/I and 6.36 ± 0.71 pmol/1 in (Group I) and 15.2 ± 3.9 mmol/I ( P < 0.01) 1 ± 3.36 pmol/1 ( P < 0.05) in the

Document Metadata

Table of Contents

NEUROGÉN GYULLADÁS, VALAMINT SZENZOROS NEUROPEPTID FELSZABADULÁS VIZSGÁLATA A CAPSAICLN- ÉRZÉKENY IDEGVÉGZŐDÉSEKBŐL FIZIOLÓGIÁS ÉS KÓROS ÁLLAPOTOKBAN

Document Metadata