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Confronto tra due sistemi per elettroforesi capillare e in gel d'agarosio per la ricerca e caratterizzazione di componenti monoclonali nel siero

Ilenia Infusino, Xxxxxxx Xxxxx, Xxxxx Xxxxxxxxxx

Laboratorio Analisi Chimico Cliniche, Ospedale “Xxxxx Xxxxx” e Cattedra di Biochimica Clinica e Biologia Molecolare Clinica, Dipartimento di Scienze Cliniche, Università degli Studi, Milano

ABSTRACT

Comparison of capillary and agarose gel electrophoresis for the identification and characterization of monoclonal immunoglobulins. The aim of this study was to compare the performance of two systems for agarose gel (AGE) and capillary (CZE) serum protein electrophoresis (SAS3/4/5 Alfa Wassermann and Paragon CZE 2000 Xxxxxxx Xxxxxxx) for the detection and characterization of monoclonal immunoglobulins (M proteins). Two independent persons reviewed 960 consecutively ordered serum protein electrophoresis patterns, 79 (8.2%) of which showed one or more M proteins at immunofixation. For M protein detection, we found similar sensitivities for AGE and CZE (89.9% vs. 94.9%, P = 0.368), with AGE showing high specificity than CZE (99.3% vs. 96.3%, P <0.0001). With regards to M protein characterization, performed on a series of 41 consecutive samples (25 of which positive for M proteins), agreement between methods was 97.6%. A good correlation (r2 = 0.947) was found when the two methods were compared for M protein quantitation (n = 180), even if a more pronounced bias was noted with M protein concentrations >25 g/L. In agreement with previously published studies, we conclude that both AGE and CZE techniques can be used in clinical laboratories for M protein detection and characterization, even if the detection specificity of AGE as a screening test is higher.

INTRODUZIONE

L'elettroforesi delle sieroproteine è un esame esegui- to praticamente in tutti i laboratori clinici, rappresentando l'indagine di laboratorio necessaria per la rilevazione di una componente monoclonale (CM) e per porre la dia- gnosi di gammopatia monoclonale (GM) (1). Di conse- guenza, essa deve essere sempre eseguita quando si sospetti un mieloma multiplo o una macroglobulinemia di Waldeström o, più in generale, è consigliato eseguirla all'ammissione in ospedale in tutti i soggetti con età superiore ai 50 anni nei quali la frequenza di GM è più elevata (2).

Tra le metodiche elettroforetiche, l'elettroforesi in gel di agarosio (AGE) rappresenta da anni il metodo di scel- ta, grazie anche alla disponibilità di sistemi semiautoma- tici in grado di eseguire con buona qualità analitica un numero elevato di campioni (3). La possibilità di modifi- care facilmente i parametri fisico-chimici di migrazione rende l'AGE un sistema molto flessibile per l'evidenzia- zione di specifiche proteine sul tracciato elettroforetico, ma anche relativamente poco standardizzabile e riprodu- cibile da un sistema analitico ad un altro. Negli ultimi anni è stata introdotta l'elettroforesi capillare zonale (CZE), che, oltre a vantaggi pratici quali la possibilità di un'ele- vata automazione, si è dimostrata capace di fornire un'accurata stima delle frazioni proteiche in spettrofoto- metria (4-6). Nella CZE la separazione delle frazioni pro- teiche avviene in un capillare di silice fusa, riempito di una soluzione tampone a cui è applicato un voltaggio molto elevato che riduce il tempo di migrazione a pochi minuti. Le proteine sono poi rilevate e quantificate

mediante misura diretta della loro assorbanza alla lun- ghezza d'onda di 214 nm, evitando quindi tutti i passag- gi (colorazione, decolorazione, diafanizzazione, asciuga- tura) necessari con la tecnica AGE per la visualizzazione delle proteine migrate.

In caso di presenza o sospetto di CM all'elettroforesi, è necessario eseguire l'immunotipizzazione della CM, mediante immunofissazione (IFE) o immunosottrazione (ISE), per confermare la presenza della CM e caratteriz- zarla immunologicamente, ovvero determinare quali catene, pesanti e leggere, costituiscono l'Ig monoclonale rilevata sul tracciato (7). La tipizzazione delle CM del siero mediante IFE avviene su lastrine di gel di agarosio e si basa sulla loro immunoprecipitazione indotta da anti- corpi specifici rivolti contro i differenti isotipi delle catene leggere e pesanti dell'Ig monoclonale dopo separazione elettroforetica. L'IFE non può essere applicata ai sistemi CZE, per i quali è stata riadattata la tecnica ISE (8), caratterizzata da una fase preliminare di immunoprecipi- tazione mediante l'impiego di specifici antisieri anti-cate- ne pesanti e anti-catene leggere seguita da separazione elettroforetica del surnatante del campione pretrattato. Il profilo elettroforetico del siero ottenuto dopo l'immuno- precipitazione è confrontato con quello del campione non trattato permettendo in tal modo di identificare la CM per differenza.

Numerosi studi sono stati condotti per valutare l'accu- ratezza diagnostica della CZE e dell'AGE nel rilevare le CM nel siero (9-13). In linea di principio, per le caratteri- stiche intrinseche alla tecnica, la CZE presenta una mag- giore sensibilità nella rilevazione delle CM rispetto all'AGE, ma questa maggiore sensibilità spesso si tradu-

ce anche in una più bassa specificità (9). Nella pratica clinica si ritiene comunque che i due metodi si equival- gano in termini di capacità diagnostica e questo ne spie- ga la diffusione nei laboratori clinici.

Lo scopo del presente lavoro è stato quello di com- parare le prestazioni di un sistema analitico in AGE e di uno in CZE nella pratica quotidiana di un laboratorio di un Ospedale universitario di medie dimensioni rappre- sentativo della realtà sanitaria italiana. In particolare, abbiamo valutato l'efficacia diagnostica dei due sistemi nella rilevazione e nella tipizzazione delle CM e le loro prestazioni analitiche attraverso lo studio dell'imprecisio- ne e del grado di correlazione nella quantificazione delle CM.

MATERIALI E METODI

Strumentazioni

Le strumentazioni sottoposte a valutazione erano lo strumento SAS3/4, dotato di modulo campionatore e preparatore SAS5 per IFE (Alfa Wassermann, software Platinum ver. 3.0) (SAS) ed il sistema Paragon CZE- 2000 (Xxxxxxx Xxxxxxx, software ver. 1.6.02) (CZE). I due sistemi analitici sono stati utilizzati esattamente come raccomandato dal produttore, avendo cura di eli- minare qualsiasi variante operativa che potesse rappre- sentare una modifica del sistema così come prodotto.

Valutazione dell'efficacia nella rilevazione della presenza di CM nel siero

Su entrambi i sistemi analitici valutati sono state ese- guite le elettroforesi di tutti i campioni con richiesta di "Elettroforesi delle sieroproteine" afferiti al nostro labora- torio nel corso di 5 giorni lavorativi consecutivi, per un totale di 960 campioni analizzati. Di questi campioni è stata eseguita la valutazione visiva dei tracciati (diretta- mente sul gel per SAS e sul grafico elaborato al compu- ter per CZE) a cura di due osservatori indipendenti, con provata esperienza nell'interpretazione di tracciati elet- troforetici, ciascuno assegnato a giorni alterni ad un sistema. Tutti i campioni, i cui tracciati elettroforetici in uno dei due sistemi valutati sono stati classificati dall'os- servatore come campioni da sottoporre ad ulteriori inda- gini (presenza certa o sospetta di CM), sono stati analiz- zati mediante un terzo sistema di IFE in AGE (Twin IFE Paragon, Xxxxxxx Xxxxxxx) (REF) per la conferma e l'e- ventuale caratterizzazione della CM. Il risultato di que- st'ultima è stato considerato come "gold standard" ed uti- lizzato per calcolare l'efficienza diagnostica di ciascun sistema valutato.

Valutazione dell'efficacia nella tipizzazione delle CM nel siero

Sono state eseguite le immunotipizzazioni di tutti i campioni pervenuti al laboratorio con richiesta di "Tipizzazione della componente monoclonale" nel corso di 10 giorni lavorativi (41 campioni totali) sia sul sistema CZE (mediante ISE) sia sul sistema SAS (mediante IFE).

Confronto dei due sistemi nella quantificazione delle CM

Nel corso di un mese lavorativo sono state seleziona- te 180 CM consecutive, corrispondenti alla totalità delle CM rilevate in tale periodo, che sono state valutate sia sul sistema SAS che sul CZE. Le misure in percentuale delle CM ottenute sui due sistemi sono state quindi espresse in g/L, moltiplicando i valori per le rispettive concentrazioni di proteinemia totale. I valori ottenuti sono stati confrontati mediante analisi della regressione e grafico delle differenze.

Valutazione dell'imprecisione nella misura delle frazioni elettroforetiche

Per la stima dell'imprecisione dei due sistemi in valu- tazione sono stati utilizzati materiali di controllo liquidi congelati (conservazione a -20 °C), Liquichek Unassayed Chemistry Control Level 2 (BioRad) per il sistema CZE e Kemtrol Serum Control Abnormal (Helena Biosciences) per il sistema SAS. I materiali sono stati analizzati sui due strumenti nel corso dell'intero stu- dio. I risultati ottenuti sono stati valutati rispetto al tra- guardo di imprecisione desiderabile (CVA) derivato dai dati di variabilità biologica intraindividuale (CVI) delle diverse frazioni proteiche nel sangue (CVA <0,5 CVI) (14). Per quanto riguarda il materiale Kemtrol Serum Control utilizzato sul sistema SAS, si è anche confronta- ta l'imprecisione ottenuta con l'impiego di materiale ali- quotato e ricongelato a -20 °C con quella del materiale utilizzato fresco, al fine di valutare il possibile effetto del ricongelamento sulla stabilità del materiale stesso.

Campioni biologici

Tutti i campioni di siero utilizzati nello studio erano residui di prelievi giunti in laboratorio con richiesta di esami clinici, resi anonimi prima dell'utilizzo.

RISULTATI

Rilevazione della presenza di CM nel siero

Dei 960 campioni analizzati, 842 (87,7%) non evi- denziavano CM su entrambi i sistemi valutati ed erano classificati come negativi. I restanti 118 campioni (12,3%), in quanto positivi per CM su almeno un siste- ma, erano ulteriormente analizzati con il sistema REF, che non evidenziava alcuna CM in 39 di essi. Pertanto, dopo la REF 881 campioni (91,8%) erano definitivamen- te classificati come negativi per CM, mentre 79 (8,2%) mostravano la presenza di una o più CM. All'esame visi- vo, il sistema CZE era in grado di rilevare 75 delle 79 CM, con una sensibilità pari al 94,9% (95% intervallo di confidenza (CI), 87,5-98,6%), mentre con il sistema SAS erano evidenziate 71 delle 79 CM, con una sensibilità pari al 89,9% (CI, 81,0-95,5%), peraltro non significativa- mente differente dalla precedente (test chi-quadro, P = 0,368). Il sistema SAS identificava correttamente 875 (99,3%) degli 881 campioni negativi per presenza di CM, con 6 falsi positivi, mentre il CZE rilevava correttamente

848 degli 881 campioni negativi per CM, con una speci- ficità del 96,3% e 33 campioni falsamente positivi per presenza di CM, con una significativa differenza rispetto alla specificità ottenuta con il sistema SAS (P <0,0001). Nel confronto diretto tra i due metodi, 51 campioni hanno presentato una classificazione discordante nella rilevazione di una CM. Questi campioni con classificazio- ne discordante sono stati riclassificati in base ai risultati del REF, con stima per ciascun sistema valutato del numero di risultati veri positivi (VP), falsi positivi (FP),

veri negativi (VN) e falsi negativi (FN) (Tabella 1).

Tipizzazione delle CM nel siero

Dei 41 campioni analizzati, 40 (97,6%) presentavano concordanza di classificazione tra IFE eseguita su SAS e ISE su CZE, mentre solo uno (2,4%) mostrava una (parziale) discordanza di classificazione. Dei campioni concordanti, 24 erano positivi per CM (10 IgGκ, 7 IgMκ, 4 IgGλ, 2 IgAλ e 1 IgAκ) e 16 erano negativi. Il campio- ne discordante era classificato in ISE/CZE come singola CM IgMκ e in IFE/SAS come doppia CM IgMκ.

Per quanto riguarda la concentrazione delle CM valu- tate, 16 (66,7%) mostravano valori compresi tra 1 e 5 g/L

e 8 (33,3%) valori >5 g/L (intervallo, 7-23 g/L).

Quantificazione delle CM nel siero

La Figura 1 mostra la buona correlazione ottenuta tra i due sistemi valutati nella misura delle CM. Tuttavia, nel

grafico delle differenze si può notare che per concentra- zioni di CM >25 g/L, i due sistemi presentavano un signi- ficativo scostamento, che diventava molto evidente nel caso che presentava la CM più marcata, misurata 65,2 g/L con CZE e 57,8 g/L con SAS, con una differenza pari a 11,3%. Tale differenza diminuiva (63,6 g/L con CZE vs. 59,8 g/L con SAS) quando il campione era rianalizzato dopo diluizione vol:vol.

Imprecisione nella misura delle frazioni elettroforetiche

La Tabella 2 riporta i risultati dell'imprecisione dei due sistemi in valutazione nella misura delle frazioni elet- troforetiche. I dati mostrano che il sistema CZE presen- tava un'imprecisione della misura di tutte le frazioni pro- teiche ampiamente entro i CV desiderabili. Il sistema SAS mostrava invece un'imprecisione accettabile per le frazioni α1- e ц-globuliniche, mentre albumina, α2- e β−glo- buline non raggiungevano il traguardo di imprecisione desiderabile.

Valutando l'imprecisione del sistema SAS utilizzando il materiale di controllo fresco e non ricongelato (n = 13), l'imprecisione della misura di albumina (CV, 1,3%) e α2-glo- buline (CV, 4,4%) si riduceva al di sotto del valore desi- derabile, mentre β1-globuline (CV, 5,8%) e β2-globuline (CV, 7,6%) continuavano a mostrare un CV superiore al traguardo di imprecisione desiderabile per la frazione β-glo- bulinica.

Tabella 1

Analisi dei casi discordanti per presenza di componente monoclonale (n=51) tra SAS e CZE alla luce del risultato ottenuto con il metodo di conferma (immunofissazione in elettroforesi in gel d'agarosio Beckman Twin IFE Paragon) (REF)

Discordanti

REF

Prestazione metodi

SAS CZE SAS CZE

12 POS 4VP+8FN 8VP+4FN

10 41

39 NEG 33VN+6FP 6VN+33FP

VP, risultati veri positivi; VN, risultati veri negativi; FP, risultati falsi positivi; FN, risultati falsi negativi.

Figura 1

Correlazione tra i due sistemi valutati nella quantificazione delle componenti monoclonali (CM) mediante analisi della regressione (figura di sinistra) e grafico delle differenze (figura di destra).

	No.	Media, %	CV	No.	Media, %	CV
Albumina	16	60,7	1,8%	20	58,0	1,1%	1,6%
α1-globuline	16	3,5	5,5%	20	6,4	3,6%	5,7%
α2-globuline	16	8,8	5,3%	20	13,2%	3,0%	5,2%
β1-globuline	16	8,8	5,2%	20	9,7%*	3,9%*	5,1%*
β2-globuline	16	6,1	6,8%	-	-	-	-
ц-globuline	16	12,4	5,2%	20	12,8	2,1%	7,3%

Tabella 2

Valutazione dell'imprecisione dei sistemi valutati nella misura delle frazioni elettroforetiche

SAS CZE

Frazione

CV desiderabile

*valore riferito alla frazione β-globulinica

DISCUSSIONE

La prevalenza della presenza di CM rilevata in que- sto studio, pari al 8,2%, è abbastanza sovrapponibile al dato riportato in letteratura che, per una popolazione ita- liana studiata in un laboratorio clinico e costituita da sog- getti ospedalizzati e non, oscillava tra 5,6% per i sogget- ti con età superiore a 50 anni e 7,6% per i soggetti con più di 75 anni (15). Anche la sensibilità nella rilevazione di CM ottenuta con i due sistemi valutati appare molto simile ai dati riportati in letteratura, che descrivono una sensibilità della CZE intorno al 95% e dell'AGE intorno al 90% (3, 16, 17). Al contrario, la specificità da noi rileva- ta per la CZE (96,3%) è sostanzialmente migliore di quella descritta in precedenza nei primi anni di impiego della metodica CZE (~80%) (17). E' possibile che l'espe- rienza maturata nel nostro laboratorio nell'impiego della metodica in CZE possa avere influito sulla riduzione delle false positività. Rimane in ogni caso per la CZE un più elevato numero di falsi positivi, e quindi una minore specificità, quando confrontata alla metodica in AGE, cosa che potrebbe impattare in maniera significativa sul- l'attività e sui costi del laboratorio per la necessità di ese- guire un maggior numero di IFE di conferma.

Fin dall'introduzione in commercio dei primi sistemi in CZE, uno degli aspetti più dibattuti è stata l'efficacia dell'ISE quando confrontata all'IFE, riconosciuto stan- dard per la caratterizzazione delle CM. Infatti, sebbene l'ISE sia eseguita in completa automazione, mostrando quindi una cadenza analitica più elevata rispetto all'IFE, automatizzabile solo in parte, per la sua intrinseca carat- teristica di sottrarre proteine alla lettura, anziché aggiun- gerne come avviene nell'IFE, potrebbe mostrare limiti di rilevazione analitica. E' stato dimostrato che l'ISE ese- guita su CZE confrontata con l'IFE in AGE mostra una sensibilità accettabile solo per CM >5 g/L, mentre per CM con concentrazioni comprese tra 1 e 5 g/L mostra una percentuale di falsi negativi intorno al 15%, che sale al 35% per CM ancora più piccole (18). Tuttavia, dai dati della nostra valutazione questa minore sensibilità del metodo ISE/CZE nei campioni con CM compresa tra 1 e 5 g/L non era evidenziabile.

Infine, la correlazione tra i due sistemi valutati nella

quantificazione delle CM appare in generale soddisfa- cente. Il maggiore scostamento tra CZE e SAS da noi ottenuto nella quantificazione delle CM con concentra- zioni >25 g/L, già descritto da altri autori utilizzando dif- ferenti sistemi analitici in AGE e in CZE, si può in linea di massima riferire ai differenti principi analitici dei due metodi di quantificazione della CM (densitometria vs. spettrofotometria) (19, 20). Nella pratica clinica, questo potrebbe comportare l'impossibilità di monitorare uno stesso paziente con mieloma o altra patologia linfoproli- ferativa maligna con le due tecniche in maniera inter- cambiabile. E' allora necessario tenere conto di queste differenze metodologiche nella valutazione clinica dei pazienti, quando in un laboratorio clinico si dovesse pas- sare da una metodologia all'altra.

Dai risultati dell'imprecisione dei due sistemi in valu- tazione si ricava che, in generale, la CZE presenta un'imprecisione migliore dell'AGE, situazione peraltro attesa in quanto la stima spettrofotometrica delle frazio- ni proteiche possiede in teoria una minore variabilità rispetto alla lettura densitometrica dell'intensità di colore delle singole frazioni utilizzata per l'AGE (5). D'altro canto, l'importanza della precisione delle misure è limita- ta dal fatto che le informazioni cliniche più importanti for- nite dall'elettroforesi si ricavano dalla valutazione visiva del tracciato, mentre la determinazione quantitativa delle singole frazioni proteiche si può ritenere solamente un dato accessorio, utile, al limite, per indirizzare la determi- nazione immunometrica quantitativa di specifiche protei- ne (2). L'unica condizione clinica nella quale la quantifi- cazione di una banda rilevata all'elettroforesi è certa- mente importante è rappresentata dalle GM. In questo caso, la fonte più importante di variabilità analitica della misura è rappresentata dalla delimitazione manuale della CM sul tracciato, comunque soggettiva e di difficile definizione per le CM di piccola entità, per cui l'assisten- za di "software" dedicati può risultare particolarmente utile (21).

In conclusione, entrambi i sistemi valutati possono essere efficacemente utilizzati nel laboratorio clinico per la ricerca e la caratterizzazione delle CM, anche se la tecnica in AGE sembra mostrare una maggiore specifici- tà nello screening elettroforetico delle stesse.

RINGRAZIAMENTI

I.I. è titolare di una borsa di studio finanziata con un contributo di liberalità da parte di Alfa Wassermann.

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