FAST-DET), cod PN-III-P2-2.1-PED-2021-2115. Contract 620
RST – Raport științific și tehnic in extenso – etapa II
Titlul proiectului: Dezvoltarea unei metode rapide bazate pe citometria in flux pentru testarea eficientei dezinfectantilor fata de bacterii izolate din infectii nosocomiale
(FAST-DET), cod PN-III-P2-2.1-PED-2021-2115. Contract 620
RST – Raport științific și tehnic in extenso – etapa II
Obiectivul etapei: Studiu comparativ între metodele standard, bazate pe cultivare și metoda FCM privind evaluarea eficienței dezinfectaților față de tulpini bacteriene aflate în suspensie.
Etapa a 2 a proiectului a cuprins următoarele activități de cercetare:
Activitate 2.1. | Determinarea condițiilor de testare a eficienței microbicide. |
Activitate 2.2. | Determinarea viabilității celulare prin metoda clasică de cultivare urmată de cuantificarea coloniilor bacteriene. |
Activitate 2.3. | Testarea eficienței dezinfectanților prin metoda citometriei |
Activitate 2.4. | Analiza statistică |
Rezumatul etapei 2
În cadrul etapei a doua a proiectului, au fost efectuate integral toate activitățile prevăzute pentru îndeplinirea obiectivului etapei. Astfel s-a realizat:
(i) Evaluarea eficienței bactericide (concentrații bactericide, reducere log), în diferite condiții de testare (timpi de contact (1, 5 și 15 minute), substanță de interferență), folosind metode standard de analiză (teste calitative / cantitative în suspensie) a unui număr de 18 dezinfectanți selectați, cu diferite mecanisme de acțiune (alcooli, compuși cuaternari de amoniu, glutaraldehidă peroxid de hidrogen, hipoclorit de sodiu, percarbonat de sodiu, amine), față de o colecție de 42 tulpini bacteriene izolate din clinică, aparținând unor specii de importanță medicală K. pneumoniae, E. coli,
P. aeruginosa, A. baumanii, S. aureus, E. faecalis.
(ii) Validarea protocolului de citometrie în flux, cu și fără marcare fluorescentă, bazat pe utilizarea modificărilor scatter și a ratei de numărare/s, pentru determinarea rapidă, în decurs de 2 ore, a eficienței bactericide a dezinfectanților selectați față de tulpini bacteriene izolate din clinică, prin analiza comparativă cu rezultatele metodelor standard, bazate pe cultivare. Etapele de lucru ale protocolului FCM, fără marcare fluorescentă, aplicat pentru determinarea eficienței bactericide a dezinfectanților sunt reprezentate grafic în Figura 1.
Reprezentarea schematică a etapelor protocolul FCM, fără marcare fluorescentă, aplicat pentru evaluarea eficienței bactericide a dezinfectanților la concentrații CMB, CMI și CMI/2.
Evaluarea eficienței bactericide prin metode standard (EN SR EN 13727+A2) a indicat diferențe semnificative între tulpini, la concentrații mai mici ale dezinfectanților față de condițiile de utilizare. Testele cantitative în suspensie au arătat diferențe în ceea ce privește eficiența bactericidă între dezinfectanți chimici cu diferite mecanisme de acțiune. Eficiența bactericidă nu fost influențată de timpul de contact. În prezența substanței de interferență, eficiența bactericidă a tuturor dezinfectanților testați a fost semnificativ redusă.
Evaluarea creșterii bacteriene prin citometrie în flux s-a bazat pe analiza semnalelor de împrăștiere a luminii (side scatter (SSC) = lumina împrăștiată în lateral și forward scatter (FSC) = lumina împrăștiată înainte) emise ca urmare a interogării individuale a celulelor bacteriene de către radiația laser (488 nm). Profilurile scatter (FSC și SSC) obținute pentru celulele bacteriene netratate cu dezinfectant au fost utilizate pentru a stabili poarta de achiziție a semnalelor scatter pentru celulele bacteriene tratate cu diferite grupe de dezinfectanți, la concentrațiile corespunzătoare valorilor CMB (concentrație minimă bactericidă), CMI (concentrație minima inhibitorie) și ½CMI (concentrație subinhibitorie). Ratele de numărare (counts/s) s-au determinat numai pentru evenimentele din poarta corespunzătare profilurilor scatter, caracteristică fiecărei tulpini bacteriene (rate de numărare/s modificate).
Analiza ratelor de numărare a bacteriilor netratate și tratate a arătat o scădere semnificativă (p<0.001) a ratelor de numărare a celulelor bacteriene tratate cu dezinfectanți la concentrații mai mari sau egale cu valoarea CMB. Un acord excelent s-a obținut între ratele de numărare modificate corespunzător profilurilor scatter, determinate prin analizele de citometrie și rezultatele metodelor standard bazate pe cultivare.
Testele de viabilitate bazate pe cuantificarea procentului de celule marcate cu iodură de propidiu (evaluarea integrității membranare) și respectiv a procentului de celule marcate cu DIBAC4(3) (evaluarea potențialului de membrană) au indicat că celulele bacteriene, tratate cu dezinfectanți la valori CMI/2, identificate pe baza profilului scatter, au prezentat valori similare controlului de celule viabile. Marcarea PI/ DIBAC4(3) a permis determinarea viabilității celulelor tratate cu dezinfectanți la valori CMI/2.
Diseminarea rezultatelor
• Articol ISI: Xxxxxxxxx, L.G. Current and Future Flow Cytometry Applications Contributing to Antimicrobial Resistance Control. Microorganisms 2023, 11, 1300. xxxxx://xxx.xxx/00.0000/xxxxxxxxxxxxxx00000000
• Conferințe naționale:
- Dezvoltarea unei metode rapide bazate pe citometria în flux pentru testarea eficacității dezinfectanților împotriva agenților nosocomiali, Xxxxxxxxx X, prezentare orală, Al XVI-lea Congres Național de Citometrie din România, 25-26 mai 2023, București
- Evaluarea activității bactericide a unor dezinfectanți asupra unor tulpini bacteriene izolate din clinică, Pîndaru AM, Popa M, Xxxxxxxxx X, Xxxxxxxxx X, prezentare orală, Sesiunea de Comunicări Științifice a Studenților Facultății de Biologie – Ediția 2023, 12.05.2023
• Lucrări de licență: Analiza prin citometrie în flux a eficienței unor dezinfectanți față de bacterii izolate din infecții nosocomiale, 2023 – student Xxxx Xxxxxxxx (Facultatea de Biologie, specializarea Biologie, secția biologie)
• Lucrări de disertație: Evaluarea activității bactericide a unor dezinfectanți prin citometrie în flux, 2023 – student Xxxxxxx Xxxxxxx-Xxxxx student Xxxx Xxxxxxxx (Facultatea de Biologie, master Laborator Medical).
• Pagina web a proiectului, actualizată cu datele generale despre proiect și cu rezultatele obținute în etapa 2. Pagina în RO – și Pagina EN