PN-III-P2-2.1-BG-2016-0369/ Contract nr. 116 BG 30/09/2016
PN-III-P2-2.1-BG-2016-0369/ Contract nr. 116 BG 30/09/2016
TRANSFERUL CUNOAŞTERII PRIVIND INVESTIGAREA PROPRIETĂŢILOR ANTIINFECŢIOASE ŞI ANTITUMORALE ALE UNOR NOI FORMULĂRI COSMETICE SI FARMACEUTICE PE BAZĂ DE EXTRACTE NATURALE
RAPORT ȘTIINȚIFIC ȘI TEHNIC FAZA DE EXECUȚIE NR. 3
CU TITLUL STUDIUL ACTIVITĂȚII ANTITUMORALE ȘI AL GENOTOXICITĂȚII EXTRACTELOR VEGETALE ȘI APICOLE ȘI ELABORAREA FIȘEI DE CARACTERIZARE COMPLETĂ A MATERIILOR PRIME ACTIVE OBȚINUTE PRIN CERCETARE INOVATIVĂ
AVIZAT
COORDONATOR | PARTENER 1 | AGENT ECONOMIC |
UNIVERSITATEA BUCURESTI | INSTITUTUL DE VIRUSOLOGIE "XXXXXX X.XXXXXXX" | HOFIGAL EXPORT IMPORT SA |
REPREZENTANT LEGAL | REPREZENTANT LEGAL | REPREZENTANT LEGAL |
PROF. XX. XXXXXX XXXXXXX | XX. XXXXXX XXXXXXXX XXXXXXX | ADMINISTRATOR XXXXXX XXXXXXX XXXXXXXX |
DIRECTOR PROIECT | RESPONSABIL P1 | RESPONSABIL DE PROIECT |
XXXXXXX XXXXXX XXXXXXXXX | XXXXXXX XXXXXX | XXXXXXXXX XXXXX |
TRANSFERUL CUNOAŞTERII PRIVIND INVESTIGAREA PROPRIETĂŢILOR ANTIINFECŢIOASE ŞI ANTITUMORALE ALE UNOR NOI FORMULĂRI COSMETICE SI FARMACEUTICE PE BAZĂ DE EXTRACTE NATURALE
RAPORT ȘTIINȚIFIC DE FAZĂ 2018
DURATA PROIECTULUI -24 DE LUNI
CUPRINS
• Obiectivul general al proiectului
• Obiectivele fazei de execuție
• Rezumatul fazei
• Descrierea științifică și tehnică
• Concluzii
• Bibliografie selectivă
OBIECTIVUL GENERAL AL PROIECTULUI
Obiectivul general al proiectului este elaborarea unei metodologii inovative de testare a activităţii antimicrobiene, antivirale, antitumorale şi imunomodulatoare, precum şi de elucidare a mecanismelor de acţiune la nivel celular şi molecular a unor extracte naturale vegetale şi apicole, în scopul introducerii acestora în noi formulări cosmetico-farmaceutice pentru extinderea gamei de produse comercializate de agentul economic participant în proiect - Hofigal S.A.
OBIECTIVELE FAZEI DE EXECUȚIE
• Studiul activității antitumorale și al genotoxicității extractelor vegetale și apicole
• Elaborarea fișei de caracterizare completă a materiilor prime active obținute prin cercetare inovativă
REZUMATUL FAZEI
În cadrul ultimei faze a proiectului au fost analizate un număr total de 15 extracte vegetale și apicole, pentru care s-a realizat studiul activității antitumorale și al genotoxicității extractelor analizate în fazele anterioare, în scopul formulării indicațiilor de utilizare ale acestora.
Cuantificarea citotoxicităţii extractelor vegetale s-a realizat utilizând kiturile CellTtiter-Glo®, şi Annexin V-FITC – iodură de propidium. Rezultatele obținute au demonstrat o relație de directă proporționalitate între gradul de reducere a viabilităţii celulare și concentraţia de extract în mediul de cultură. Concentrațiile la care extractele testate au fost non-toxice la 24 h au fost: 10% pentru soluțiile apoase de propolis, de 1% de extract de armurariu și rozmarin, de 0,1% pentru extractul de rostopască și pentru tincturile de propolis, de 0,05% pentru extractul de lemn dulce și de 0,01% pentru extractul de cătină roșie.Tincturile de propolis, la fel ca şi extractele vegetale de cătină, rostopască, armurariu, lemn dulce, rozmarin induc o activare a activităţii caspazice globaleîn celulele tumorale Hep-2, cuantificată cu ajutorulkitului carboxifluorescein multi-caspase activity (bml-ak117-001).
Analiza ciclului celular al celulelor tumorale Hep-2 a aratat că extractele vegetale sunt blocanti de faza G2, iar tratarea celulelor cu concentrații de 5 ori mai mari decât concentraţia non- citoxică de extracte vegetale sau combinaţii ale acestora au indicat faptul că extractele de cătină și de rostopască, precum și amestecul rostopască-cătină, cătină-lemn dulce, rostopască –lemn dulce și rostopască cătină–lemn dulce induc apariția apoptozei (faza subG0), demonstrând efectul antitumoral al acestora.
Evaluarea și testarea genotoxicității s-a realizat pentru extractele naturale cele mai active, din punct de vedere al acțiunilor biologice urmărite, și care au făcut obiectul cererilor de brevet depuse sau care urmează a fi depuse, respectiv extractele totale concentrate de rostopască, cătină roșie și lemn dulce.
Extractul total de rostopască de concentratie 0,1% a determinat o incidență scăzută a micronucleilor, comparativ cu controlul negative, în timp ce concentrația de 0,2% a prezentat o capacitate genotoxică crescută. În cazul extractului de cătină roșie s-a constat scăderea incidenței micronucleilor sub limita controlului negativ, concomitent cu scăderea proliferării celulare, probabil ca urmare a inhibării diviziunii celulare.Extractul de lemn dulce în concentrație de 0,02% prezintă o incidență scăzută a micronucleilor, și consecutiv, o genotoxicitate scăzută
În cadrul acestei etape, s-a realizat, de asemenea, transferul cunoștintelor către HOFIGAL, cu privire la procedurile de evaluare a efectului antiproliferativ, atimicrobian, citotoxic, imunomodulator al extractelor vegetale și apicole și al unor combinații ale acestora, în cadrul unui workshop.
Au fost comunicate agentului economic indicațiile terapeutice ale extractelor naturale testate (antimicrobiene, antivirale, antiproliferative, imunomodulatoare), în funcție de analiza tuturor rezultatelor obținute.
Diseminarea rezultatelor proiectului în anul 2018 s-a realizat prin comunicarea rezultatelor de cercetare în cadrul a 4 conferințe naționale, publicarea a 4 articole ISI, 1 articol BDI, 1 capitol într-o carte publicată în editură internațională, 2 brevete de inventie, 1 workshop final, 2 teze de licență, capitol din 2 teze de doctorat.
În concluzie, obiectivele propuse în cadrul acestei etape, precum și livrabilele propuse au fost realizate în totalitate.
RAPORT ȘTIINȚIFIC ȘI TEHNIC
Introducere
Plantele au fost utilizate încă din cele mai vechi timpuri pentru tratarea sau prevenția diferitelor tipuri de afecţiuni, fiind folosite de 65-80% din populaţia lumii, în conformitate cu datele furnizate de Organizaţia Mondială a Sănătăţii. De asemenea, aproape jumătate dintre medicamentele utilizate în prezent sunt agenți de semisinteză care au ca materii prime fitocomponente specifice, iar un sfert dintre ele conțin extracte sau compuși chimici activi din plante (Xxxxx, 1999). Bolile infecțioase rămân una din principalele cauze de mortalitate la nivel mondial. Necesitatea identificării de noi substanțe antimicrobiene este evidentă, mai ales în cazul bacteriilor Gram-negative multirezistente, dintre care unele specii sunt incluse în grupul ESKAPE (ex. Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa și Enterobacter sp.) responsabile, în multe cazuri, de infecții netratabile cu agenții antimicrobieni existenți (Santajit și Indrawattan, 2016). Pe de altă parte, în ciuda progreselor care s-au înregistrat în obţinerea vaccinurilor și dezvoltarea medicamentelor, pentru multe virusuri, terapiile antivirale sunt ineficiente sau lipsesc; astfel, identificarea de noi medicamente / adjuvanţi antivirali este foarte importantă. Totodată, cancerul rămâne cauza principală de mortalitate la nivel mondial, în timp ce agenți chimioterapeutici de sinteză introduși în clinică pe parcursul ultimului deceniu nu au dovedit o eficienţă mai bună, în ciuda costurilor considerabile și a perioadei lungi de dezvoltare a acestora.
Plantele sintetizează o serie de substanțe farmacologic active, reprezentând o alternativă ecologică valoroasă pentru tratamentele antiinfecțioase și antitumorale clasice, având un statut relativ sigur și larg acceptat de către consumatori, datorită riscului redus al efectelor secundare, activităților biologice diverse, inclusiv imunomodulatoare, care ar putea potența activitatea antimicrobiană, antivirală și antitumorală. Datorită compoziției lor complexe, aceste extracte naturale acționează concomitant prin diferite mecanisme (degradarea peretelui celular, inhibarea formării biofilmelor microbiene, deteriorarea membranei citoplasmatice şi/sau a proteinelor membranare, coagularea citoplasmei, inhibarea glicolizei și a transportului de glucoză etc.) (Xxxx, 2004).
Numeroşi compuşi naturali de origine vegetală studiaţi cu precădere în ultimele două decenii au demonstrat un potenţial efect antimicrobian, antiviral și antitumoral (Xxxxxxx şi colab., 2014).
În continuare vor fi prezentate sintetic principalele rezultate obținute în cadrul activităților menționate în planul de realizare aferent etapei III de execuție a proiectului.
Activitate 3.1. Testarea citotoxicităţii pe linii celulare normale și tumorale
Analiza cantitativă a toxicităţii induse de extractele vegetale s-a realizat utilizând kitul CellTtiter-Glo®, pe scurt, celulele au fost tripsinizate, numărate şi însămânţate în plăci albe de 96 de godeuri (NUNC, SUA) la o densitate de 7,5x103celule per godeu (Hep2 VSHE; HT-29 (ATCC® HTB- 38 ™). Plăcile s-au incubat în mediu Dulbecco modificat (DMEM:F12) (Sigma, USA), suplimentat cu ser bovin fetal 10% inactivat termic (Sigma, USA), la 37°C, in atmosferă umedă cu 5% CO2 timp de 24 de ore. Pentru a evalua citotoxicitatea extractelor, celulele au fost tratate cu diluţii seriale şi menţinute timp de 24 de ore la 37°C, în atmosferă umedă cu 5% CO2. Viabilitatea celulară a fost determinată folosind kitul CelITiter-Glo® (Promega, G7572). Pentru determinarea viabilităţii celulelor, în fiecare godeu s-a adaugat un volum egal de reactiv CelITiter-Glo®. Plăcile s-au incubat la temperatura camerei timp de 10 minute pentru a permite stabilizarea semnalului luminescent. Luminiscenţa s-a citit la un FilterMax F5 Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices, SUA). Rezultatele au fost interpretate ca procent de celule viabile după tratamentul cu diferite concentraţii de extract raportat la viabiabilitatea celulelor netratate.
Cuantificarea toxicităţii induse de extractele testate arată o reducere progresivă a viabilităţii celulare odată cu creşterea concentraţiei de extract în mediul de cultură.
Activitate 3.2. Teste de proliferare celulară: analiza ciclului celular, analiza apoptozei, testul clonelor celulare
Pentru confirmarea rezultatelor, concentratiile non-citotoxice au fost analizate utilizând kitul Annexin V-FITC – iodură de propidium, care cuantifică apoptoza şi necroza celulelor.
Pentru a detecta apoptoza timpurie se cuantifică externalizarea fosfatidil serinei în celulele apoptotice utilizând annexin V conjugată cu FITC, în timp ce apoptoza târzie se cuantifică utilizând iodură de propidium (PI). Astfel, la 24 de ore de la tratamentul cu 0,1% extract, celulele se tripsinizează, se spală în TFS şi se resuspendă în 200 μL tampon de legare pre-diluat, ajustându-se la o densitate de 2-5 x 105 celule/mL. Ulterior, suspensia celulară a fost marcată cu 5 μL Annexin V: FITC, 10 minute la întuneric la temperatura camerei, spălată cu tampon de legare pre-diluat şi colorată cu 10 μL soluţie de iodură de propidiu pentru evidenţierea celulelor moarte.
Rezultatele sunt prezentate ca procent de celule viabile /necrotice /apoptotice (figurile 1-2).
100 90 80 70 60 necroza 50 apoptoza secundara 40 apoptoza 30 celule vii 20 10 0 Hep Catina Armurariu Rozmarin Lemn dulce Rostopasca 0,01% 1% 1% 0,05% 0,1% | |||||||
Hep | Catina 0,01% | Armurariu 1% | Rozmarin 1% | Lemn dulce 0,05% | Rostopasca 0,1% | ||
necroza | 0.013 | 14.6 | 4.3 | 1.17 | 2.45 | 2.69 | |
apoptoza secundara | 0.018 | 4.48 | 5.63 | 1.16 | 0.379 | 3.47 | |
apoptoza | 0.31 | 2.43 | 1.7 | 0.369 | 0.12 | 2.78 | |
celule vii | 99.7 | 78.5 | 88.4 | 97.3 | 97.1 | 91.1 | |
% celule
% celule
Fig. 1. Reprezentarea grafică a toxicităţii extractelor vegetale testate.
100 | ||||||
90 | ||||||
80 | ||||||
70 | ||||||
60 | necroza | |||||
50 | apoptoza secundara | |||||
40 | apoptoza | |||||
30 | celule vii | |||||
20 | ||||||
10 | ||||||
0 | ||||||
30% APS (10%) | 50% APS (10%) | 30% PT (0,1%) | 50% TPS (0,1%) | |||
30% APS (10%) | 50% APS (10%) | 30% PT (0,1%) | 50% TPS (0,1%) | |||
necroza | 5.62 | 4.29 | 2.92 | 4.42 | ||
apoptoza secundara | 1.77 | 0.99 | 2.52 | 2.55 | ||
apoptoza | 0.354 | 0.13 | 0.507 | 0.577 | ||
celule vii | 92.3 | 94.6 | 94 | 92.5 | ||
Fig. 2. Reprezentarea grafica a toxicităţii extractelor apoase de propolis si tincturilor de propolis testate.
Demonstrarea activităţii caspazice globale s-a realizat utilizând kitul carboxifluorescein multi- caspase activity (bml-ak117-001).
Caspazele (Cysteinyl Aspartate-Specific Proteases) sunt o familie de enzime cu rol important în apoptoză (moartea programată a celulelor). Kitul Carboxyfluorescein Multi-Caspase Activity (BML- AK117-001) detectează apoptoza prin legarea covalentă a unei sonde fluorescente verzi de caspazele active din celulele vii. FAM-VAD-FMK este un derivat al valylalanylaspartic acid fluoromethyl ketone (VAD-FMK). Acesta este un inhibitor al activităţii caspazice, prin legare la Cys285 pe heterodimerii caspazici. Utilizarea substratului VAD permite detecţia globală a caspazelor 1-9, iar cuantificarea fluorimetrică permite evaluarea cantitativă a activităţii acestora. Pentru evaluarea activităţii caspazice, celulele au fost însamantate în plăci de 24 godeuri la o densitate de 3x105 celule/mL. La 24 ore s-a realizat tratamentul cu extractele vegetale în concentraţiile cunoscute/stabilite. Densitatea celularăîn recipientul de cultură nu trebuie să depășească 106 celule /mL deoarece celulele cultivate în exces faţă de această concentraţie pot induce apoptoza naturală. Totuși concentrația celulară optimă variază în funcție de linia celulară. La 24 ore de la tratament celulele au fost reluate de pe substrat, numărate, și împărţite în două aliquote la o concentratie de 105celule /100microL. Un aliquot a fost tratat cu 2,5 microL FAM-VAD-FMK/ 100 micoL suspensie celulara, agitat și incubat o oră la 370C, % CO2, protejat de lumină. Celulele au fost spălate de 2 ori cu lichid de spălare, iar câte 100 microL din fiecare suspensie celulară au fost puși în duplicat într-o placă de microtitrare neagră. Intensitatea fluorescenţei fluoresceinei (excitaţie 490nm, emisie 520nm) a fost cuantificată la reader. Rezultatele sunt prezentate ca log a raportului dintre valoarea integrată probei tratate vs control celule netratate.
Tincturile de propolis, la fel ca şi extractele vegetale de cătină, rostopască, armurariu, lemn dulce, rozmarin induc o activare activităţii caspazice globale.
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
-0.05
-0.1
-0.15
Log10 (relative quantitation)
Fig. 3. Reprezentarea grafică activităţii caspazice induse de tratamentul cu concentratii slab citotoxice.
Analiza ciclului celular
Celulele tratate cu concentrații slab toxice de extracte vegetale sau combinaţii ale acestora au fost tripsinizate, spălate în tampon fosfat salin (TFS) şi fixate în 1 ml etanol 70% rece, cel puţin 30 de minute la -20ºC. Celulele au fost spălate în TFS, resuspendate în 100 μl TFS, tratate cu RNAză (concentraţie finală 1 mg/ml) la 37ºC timp de 30 minute şi colorate cu PI (concentrație finală 100 μg/mL) timp de 30 de minute la 37ºC, cu agitare periodică. Probele au fost citite la citometrul în flux Xxxxxxx Xxxxxxx XLM şi analizate cu programul FlowJo.
Analiza ciclului celular al celulelor tumorale Hep-2 a aratat că extractele vegetale sunt blocanți de faza G2, iar tratarea celulelor cu concentrații de 5 ori mai mari decât concentraţia non-citoxică de extracte vegetale sau combinaţii ale acestora au indicat faptul că extractele de cătină și de rostopască, precum și amestecul rostopască-cătină, cătină-lemn dulce, rostopască –lemn dulce și rostopască cătină– lemn dulce induc apariția apoptozei (faza subG0), demonstrând efectul antitumoral al acestora.
Fig. 3. Histograme ciclului celular al celulelor Hep2 tratate cu extracte vegetale și combinaţii ale acestora.
Activitate 3.3. Transferul cunoștintelor către HOFIGAL, cu privire la procedurile de evaluare a efectului antiproliferativ al extractelor vegetale și apicole și al unor combinații ale acestora
Transferul cunoștințelor către Xxxxxxx s-a realizat în cursul stagiilor de perfecționare în cadrul Institutului de Virusologie Xxxxxx X Xxxxxxx și al Facultății de Biologie. În cadrul Institutului de Virusologie Xxxxxx X Xxxxxxx (fig. 4) subiectele abordate în timpul trainingului au inclus:
• laboratorul de culturi celulare: tehnici aseptice, întreținerea de rutină a culturilor celulare, tehnicile de cultură specializate și diverse aplicații (colorații; metode spectrofotometrice; evidențierea și cuantificarea virusului în cultură);
• laboratorul de citometrie în flux: analiza ciclului celular, detecția apoptozei utilizând kitul anexin V-FITC- iodura de propidium;
• laboratorul de proteomică: dot blot, Western Blot pentru o serie de biomarkeri din căile de semnalizare activateîn urma tratamentului cu extracte vegetale sau apicole; detecția și cuantificarea citokinelor în sistem multiplex pe bile magnetice utilizând aparatul Bio-Plex 200 etc;
• laboratorul de biologie moleculară: RT-real time –PCR pentru evidențierea nivelului de expresie a anumitor biomarkeri în urma tratamentului cuextracte vegetale; evidențierea metilării globale și a unor biomarkeri specifici etc.
A. B.
Fig. 4. A.Învățarea procedurilor de colectare a sângelui total prin puncție cardiacă (Biobaza Institutului de Virusologie Xxxxxx X. Xxxxxxx); B. Insuşirea teoriei și practicilor necesare pentru inițierea și menținerea cu succes a culturilor de celule animale de către angajații Hofigal.
În cadrul Institutului de Cercetări al Universității din București subiectele abordate în timpul trainingului au inclus determinarea activității antimicrobiene și antibiofilm a extractelor vegetale: determinarea concentrației minime inhibitorii prin metoda microdiluțiilor, concentrației minime de eradicare a biofilmelor prin metoda microtitrării, zonelor de inhibiție a creșterii prin metoda difuzimetrică.
Activitate 3.4. Studiul genotoxicității extractelor vegetale și apicole și al unor combinații ale acestora
Evaluarea și testarea genotoxicității s-a realizat pentru extractele naturale cele mai active, din punct de vedere al acțiunilor biologice urmărite, și care au făcut obiectul cererilor de brevet depuse sau care urmează a fi depuse, respective extractul de rostopască (extract total concentrat) Chelidonium majus, cătină roșie (Tamarix gallica) și lemn dulce (Glycyrrhiza glabra).
Conform OEDC, testul de micronucleaţie in vitro (487 OEDC Guideline) este recomandat ca un test de bază pentru evaluarea și caracterizarea capacității genotoxice a agenților chimici/farmaceutici. Este utilizat în scopul detectării micronucleilor în citoplasma celulelor interfazice. Micronucleii sunt fragmente cromozomale acentrice (fără centromer) sau cromozomi întregi incapabili de a migra la unul din cei doi poli ai celulei în timpul anafazei mitotice. Acest test detectează activitatea clastogenică și aneugenică a unor agenți chimici, în celule care au parcurs diviziunea celulară în timpul sau după expunerea la substanța de testat. Prin intermediul testului de micronucleaţie in vitro (MNvit) se poate determina rapid frecvența leziunilor cromozomale precum și a perturbărilor în desfășurarea ciclului celular produse de un agent chimic (care este testat). Acest test a câștigat mai multă popularitate față de testul detectării aberațiilor cromozomale (CAAT) deoarece este mult mai fezabil, ușor de realizat, rapid și mai sensibil în detectarea leziunilor subtile provocate de agenții aneugeni și clastogeni. Pentru evaluarea genotoxicității prin testul MNvit, sângele periferic a fost recoltat de la o persoană feminină, de vârstă medie, sănătoasă, care nu a fost expusă recent la agenți genotoxici (substanțe chimice, radiatii ionizante, infecții bacteriene/virale). Sângele periferic a fost recoltat pe anticoagulant (heparină) și transferat în mediu PB-MAX (GIBCO) suplimentat cu fitohemaglutinină (agent mitogen), BSA, aminoacizi și antibiotic. Culturile au fost incubate la 37°C, 5%CO2. Fiecare probă, inclusiv controlul negativ, a fost realizată în duplicat. După 48 de ore culturile de limfocite au fost tratate cu extracte vegetale, după cum urmează:
• Extract total de rostopască: concentrațiile 0,1% (concentrația A) și 0,2% (concentrația B);
• Extract de cătină roșie: concentrațiile: 0,02% (concentrația A) și 0,1% (concentrația B);
• Extract de lemn dulce: 0,02% (concentrația A) și 0,05% (concentrația B).
Ulterior, culturile de limfocite sacrificate la 24 de ore după adaugarea extractelor timp suficient pentru ca celulele să treacă prin mai multe runde de diviziune celulară astfel încât, să se poată identifica potențialele leziuni ADN sub forma de micronuclei în celulele interfazice. Sacrificarea s-a realizat prin
hipotonizare în soluție de KCl 0,075M și fixarea celulelor în soluție de methanol/acid acetic 3:1. Preparatele microscopice din suspensia celulară au fost colorate în soluție Giemsa (Merck). Lamele microscopice au fost tratate în prealabil cu Tripsina-EDTA 10X. Analiza preparatelor microsopice s-a realizat la microscopul Olympus BX40 și analizate cu ajutorul programului QuickPhotoMicro 2.3. Culturile de limfocite s-au realizat fără cytochalasin B, fiind astfel necesară măsurarea indicelui RICC (Relative Increase in Cell Count) astfel încât, să se demonstreze faptul că celulele din cultură au parcurs diviziunea celulară (s-a evitat răspunsul fals pozitiv). Astfel, dacă citotoxicitatea depășește 60%, apariția micronucleilor este un efect secundar al citotoxicității, astfel încât nu poate fi evaluată incidența micronucleilor ca urmare a genotoxicicității substanței.
Rezultate: conform indicelui RICC a fost calculată citotoxicitatea pentru fiecare concentrație și pentru fiecare tip de extract. Concentrațiile testate au fost alese în funcție de valoarea concentrației minime inhibitorii și de eradicare a biofilmelor microbiene. Citotoxicitatea extractelor testate s-a încadrat în limitele de admisibilitate pentru o analiză de acuratețe a genotoxicității, putându-se evalua incidența micronucleilor.
Incidența micronucleilor raportat la numărul nuclieilor viabili (‰)
14
12
10
8 Concentratia A
Concentratía B
6
Control
4
2
0
C. majus T gallica G. glabra
negativ.
Fig. 5. Reprezentarea grafică a incidenței micronucleilor (‰) în extractele naturale studiate raportat la controlul
Extractul total de C. majus de concentratie 0,1% a determinat o incidență scăzută a
micronucleilor, comparativ cu controlul negativ și reprezintă o concentrație favorabilă evaluării
capacității genotoxice. Creșterea concentrației la 0,2% în cele două replici ale culturii a determinat o incidență ridicată a micronucleilor și deci, o capacitate genotoxică crescută.
În cazul extractului de T. gallica s-a constat scăderea incidenței micronucleilor sub limita controlului negativ, concomitent cu scăderea proliferării celulare, probabil ca urmare a inhibării diviziunii celulare. Extractul de G. glabra la concentrația de 0,02% a indus o incidență scăzută a micronucleilor raportat la control, deci o genotoxicitate scăzută (fig. 5).
Activitate 3.5. Formularea indicațiilor terapeutice ale extractelor naturale testate, ca substanţe farmaceutice active din punct de vedere al calității și sigurantei, în conformitate cu prevederile legislatiei în vigoare
Tabelul 1. Indicațiile terapeutice ale celor mai active extracte testate
Extract | Activitate antimicrobiană | Activitate antivirală | Activitate antitumorală | Activitate imunomodulatoare | Siguranță | |||||
Activitate antibacteriană | Activitate antibiofilm | Activitate virulicidă HSV2/HSV1/ADV5 (log inhibitie) | Acțiune profilactică (log inhibitie) HSV2/HSV1/ADV5 | Blocarea CC/ Efect pro- apoptotic (concentratie %) | Stimularea activității caspazice | Efect pro-inflamator | Efect anti-inflamator | Citotoxicitate (24h) | Efect genotoxic | |
Tinctură de propolis 30% | 2,5/2,7 | 1,3/0 | 0,1 (>24h) | 0,25 | <0,1% | |||||
Tinctură de propolis 50% | 3/2,7 | 2/0,05/ | 0,1 (>24h) | 0,15 | <0,1% | |||||
Soluție apoasă de propolis 30% | 3,5/0,7 | 1,5/0,4 | 10 | -0,09 | 1% | |||||
Soluție apoasă de propolis 50% | 1,15/0,7 | 0,8/0,4 | 10 | -0,06 | 1% | |||||
Extract total concentrat (ETC) de rostopască | 2/3,3/1,3 | 1,3/2/1 | ≥0,25 | 0,12 | 0,05% | |||||
ETC de cătină roșie | 4/4,3/4,3 | 0,6/0,7/1 | 0,05 | 0,23 | <0.01% | |||||
ETC de armurariu | 2/2,3/2,3 | 0,3/1/0,3 | 1%(>24h) | 0,13 | 1% | |||||
ETC de rozmarin | 2/3/3 | 1,3/0/0,3 | 10% | 0,18 | 1% | |||||
ETC de lemn dulce | 3/3/2,3 | 1,3/0,3/0,3 | 0,05 | 0,11 | <0.01% | |||||
Tabelul 2. Indicațiile terapeutice ale compozițiilor cu efecte terapeutice superioare extractelor individuale
Extract | Activitate antimicrobiană | Activitate antivirală (log inhibitie) - HSV2/ADV5/ECHO | Activitate antitumorală | Activitate imunomodulatoare | Siguranță | |||||
Activitate antibacteriană | Activitate antibiofilm | Activitate virulicidă | Acțiune profilactică (extract conc. nontoxica) | Acțiune antivirală (extract conc. nontoxica) | Blocarea CC/ Efect pro- apoptotic (concentratie %) | Activitate antibiofilm | Activitate virulicidă | Citotoxicitate (24h) | Efect pro-apoptotic | |
Rostopască- | 2/2,7/2 | 0,3/0/1 | 0,3/2/0,3 | 0,25/0,05 | 0,05- | |||||
cătină roșie | (>24h) | 0,01 | ||||||||
Rostopască- | 1,7/1/1 | 1/0/1 | 0/2,6/0 | 0,25/0,05 | 0,05- | |||||
lemn dulce | (>24h) | 0,01 | ||||||||
Cătină-lemn | 2/2,7/2 | 0,6/0/1,6 | 0,3/2/0,3 | 0,05/0,05 | 0,01- | |||||
dulce | (>24h) | 0,01 | ||||||||
Rostopască- | 2/2,7/1 | 0/0/0,3 | 0,3/3/0,3 | 0,25/0,05/0,05 | 0,05- | |||||
lemn dulce- | (>24h) | 0,01- | ||||||||
cătină | 0,01 | |||||||||
Activitate 3.6. Diseminarea rezultatelor proiectului
Comunicarea rezultatelor de cercetare în cadrul unor conferințe anuale (Cel puţin 2 conferinţe
/an)
1. Dunya A. Xx-Xxxxxxx, Xxxxx Xxxxx, Xxxxxxx Xxxx, Xxxx Xxxxx Xxxxxx, Xxxxxx Xx-Xxxxxxx, Xxxxxxx Xxxxxxxx, Xxxxxxx Xxxxxx Xxxxxxxxx, Antifungal activity of some plant extracts on non- Candida albicans spp. strains isolated from hospitalized patients. ESENIAS and DIAS Scientific Conference and 8th ESENIAS Workshop. 26 – 28 September 2018, București, România
2. Xxxxxx Xxxxx, Xxxxxxxx Xxxxxxxxx, Xxxxxxx Xxxx, Xxxxxx Xxxxxxxxx, Xxxxxxxx Xxxxx, Antimicrobial activity of medicinal plants essential oils and their synergy with antibiotics on adherent microbial cells. Sesiunea de Comunicări Științifice a Studenților Facultății de Biologie
– Ediția 2018, 19.05.2018, București, România
3. Xxxxx Xxxxx, Xxxxx Xxxxxxxx Xxxxxx, Xxxxxx Xxxxx, Xxxxxxxx Xxxxx, Xxxxxxx Xxxxxxxxxx- Xxxxx, Xxxxx Xxxxxx, Xxxxx xxxxxx, Xxxxxxxx Xxxxxxx, Xxxxx Xxxxx Xxxxx, Xxxxxxx Xxxxxxxx, Xxxxxx Xxxxxxxx Xxxxxxx, Xxxxxxx Xxxxxx, Xxxxxxx Xxxxxx. The antiviral and immunomodulatory activities of Chelidonium majus L. and of Tamarix gallica extracts. Poster prezentat la a XIII-a editie a Simpozionului Academician Xxxxxxx Xxxxx, 22-24 martie, 2018, București, România
4. Xxxxx XXxxxx, Xxxxx Xxxxx, Xxxxx Xxxxxxxx Xxxxxx, Xxxxxx Xxxxx, Xxxxxxx Xxxx, Xxxxxxxx Xxxxxxxxx, Xxxxxxxx Xxxxx, Xxxxxxx Xxxxxxxxxx, Xxxxx Xxxxxx, Xxxxxxxx Xxxxxxx, Xxxxx Xxxxx Xxxxx, Xxxxxx Xxxxxxxx Xxxxxxx, Xxxxxxx Xxxxxx, Xxxxxxx Xxxxxx, Three medicinal plants tested for their antimicrobial and antiviral activity, 2nd World Congress and Expo on Traditional and Alternative Medicine, 14-16.06.2018, Roma Italia – premiul pentru cel mai bun poster
5. Xxxxx Xxxxx, Xxxxxx Xxxxxx, Xxxxxx Xxxxx, Xxxxx Xxxxxx, Xxxxx Xxxxxx, Xxxxxxx Xxxxxxxxxx, Xxxxxx Xxxxxxxx Xxxxxxx, Xxxxxxx Xxxxxx. The influence of micro-media on the glioblastoma cells features, Zilele Medicale și Științifice ale Institutul Oncologic Prof. univ. xx. Xxxxxxxxx Xxxxxxxxxxxx - Abordarea multidisciplinară a pacientului oncologic, 17-19.05.2018, București, România
Trimiterea spre publicare a articolelor de cercetare către reviste internaționale
Articole ISI
1. Xxxxxx Xxxxx, Xxxxx Xxxxxxxx, Xxxxxxxx Xxxxxxxxx, Xxxxx Xxxxxxxx, Xxxxxxx Xxxx,Xxxxxxxx X Xxxxxxxxxxxx, Xxxxxxx Xxxxxx Xxxxxxxxx, Xxxxxxxx Xxxxx, 2018. Antifungal activity of some medicinal plant extracts against Candida albicans nosocomial isolates, Romanian Biotechnological Letters, 23(6):14074-14079, doi:10.26327/RBL2018.190 xxxxx://xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx.xxxxxxxxx.xxx/0000/00/00/xxxxxxxxxx-xxxxxxxx-xx- some-medicinal-plant-extracts-against-candida-albicans-nosocomial-isolates/
2. Xxxxxxxx Xxxxx, Xxx Xxxx Xxxx, Xxxxxxxx Xxxxxxxxxxx Xxxxxxxxxxxx, Xxxxx Xxxxxxxx, Xxxxxx Xxxxxxx, Xxxxx Xxxxx Xxxxxx, Xxxxxx xxxx, Xxxxx Xxxxx, Xxxxxxx Xxxxxx Xxxxxxxxx, 2018. Aspects of Gut Microbiota and Immune System Interactions in Infectious Diseases, Immunopathology, and Cancer. Frontiers in Immunology, 9, 1830. doi:10.3389/fimmu.2018.01830
xxxxx://xxx.xxxxxxxxxxx.xxx/xxxxxxxx/00.0000/xxxxx.0000.00000/xxxx
3. Xxxxxx Xxxxxx, Xxxxxxxxx Xxxxxx Xxxxxx, Xxxxx Xxxxxx Xxxxxxx, Xxxxxxxxx Xxxxx Xxxxxxxxxx, Xxxxxxx Xxxxxx Xxxxxxxxx, Xxxxxxx Xxxxxx, Xxxxxxxx Xxxxxxxxx, Xxxxxx Xxxx Xxxxxxxxx, Xxxxx Xxxxxxx Xxxx, 2018. Novel hybrid formulations based on thiourea derivatives and Core@Shell Fe3O4@C18 nanostructures for the development of antifungal strategies, Nanomaterials, 8 (47), doi:10.3390/nano8010047
xxxxx://xxx.xxxx.xxx/0000-0000/0/0/00
4. Xxxxx X.Xx-Xxxxxxx, Xxxxx Xxxxxxxx, Xxxxxxx Xxxx, Xxxxxxxx X Xxxxxxxxxxxx, Xxxxxxx Xxxxxxxx, Xxxxxxxx Xxxxxxxxx, 2018. Characterization of non-albicans Candida species involved in human infections, Romanian Biotechnological Letters, doi:10.26327/RBL2018.167 xxxxx://xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx.xxxxxxxxx.xxx/0000/00/00/xxxxxxxxxxxxxxxx-xx-xxx- albicans-candida-species-involved-in-human-infections/
Articole BDI
5. Xxxxxx Xxxxx, Xxxxx Xxxxxxxx, Xxxxxxxx Xxxxxxxxxxx Xxxxxxxxxxxx, Xxxxxxx Xxxxxx Xxxxxxxxx, Xxxxxxxx Xxxxx, 2018. Genotypic characterization of adhesion and biofilm development genes in Candida albicans strains isolated from different clinical specimens, Biointerface Research in Applied Chemistry, 8(5):3590-3593
xxxx://xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx.xxx/
Capitole în cărți internaționale
1. Xxxxxxxx X. Xxxxxxxxxxxx, Xxxxxx Xxxx, Xxxxx Xxxxx, Xxxxxxx Xxxx, Xxxxxxx Xxxxxx Xxxxxxxxx, 2018. The Intricate Relationship between Diabetes, Diet and the Gut Microbiota. Additional information is available at the end of the chapter. xxxx://xx.xxx.xxx/00.0000/xxxxxxxxxx.00000
Brevete de inventie (Cel puţin 2 brevete de invenţie)
În urma analizei rezultatelor obținute au fost selectate 2 produse care au prezentat acțiune multi- farmacologică, care au făcut obiectul a 2 cereri de brevet:
1. Cerere brevet inventie A/00846 - Procedeu de obținere a unui extract total concentrat de rostopască (Chelidonium majus) cu activitate antimicrobiană, antivirală, antitumorală și imunomodulatoare
2. Cerere brevet inventie A/00854 – Procedeu de obținere a unui extract total concentrat de cătină roșie (Tamarix gallica) cu activitate antimicrobiană, antivirală, imunomodulatoare și antiproliferativă
Workshop final
În perioada 16 Septembrie – 4 Octombrie, în cadrul unui workshop, a fost realizat transferul cunoașterii privind investigarea proprietăţilor antiinfecţioase şi antitumorale ale unor noi formulări cosmetice si farmaceutice pe bază de extracte naturale către gentul economic, prin prezentarea metodologiei utilizate si discutarea modului de valorificare a rezultatelor obținute (selectarea produselorpentru brevetare, respectiv agreerea planului de diseminare a rezultatelor nepublicate, după finalizarea proiectului).
Link eveniment: http://xxxx.xxxxxx.xx/index.php/component/jevents/eventdetail/1105/49%7C50%7C51%7C52%
7C63/workshop-metode-de-investigare-a-proprietatilor-antiinfectioase-si-antitumorale-ale-unor- extracte-naturale-si-apicole?Itemid=1
Realizarea tezelor de finalizare a studiilor
În cadrul acestui proiect au fost implicați 2 studenți și 2 doctoranzi, care și-au realizat partea experimental a tezelor de licență, masterat sau unele capitol din tezele de doctorat, cu titlurile:
Licenţă – 2018 – Xxxxxxxx X. Xxxx-Xxxxxx – Studiul influenţei unor produși apicoli și vegetali asupra microbiotei – Coordonator: Xxxxxxx Xxxxxx
Licenţă – 2018 – Xxxxxxx X. Namoni - Efectul imunomodulator și antimicrobian al extractelor vegetale
– Coordonator: Xxxxxxx Xxxxxx Xxxxxxxxx
Doctorat –în pregătire - Xxxxxx Xxxxx Xxxxx - Biological activity of vegetal total extracts and essential oils on antibiotic resistant microbial strains and biofilm forming microorganisms Coordonator prof. xx. Xxxxxxxx Xxxxx
Doctorat – în pregătire – Xxxxx Xxxxxx – Studiul activităţilor biologice ale unor extracte totale și ale unor fracţii ale acestora provenite din flora autohtonă Coordonator prof. xx. Xxxxxxxx Xxxxx
Concluzii
• În cadrul ultimei faze a proiectului au fost analizate un număr total de, pentru care s-a realizat studiul activității antitumorale și al genotoxicității extractelor analizate în fazele anterioare, în scopul formulării indicațiilor de utilizare ale acestora.
• Testarea citotoxicităţii a 15 extracte vegetale și apicole extractelor vegetale celule Hep2 VSHE și HT-29 a permis stabilirea gamei de concentrații la care extractele testate au fost netoxice, respectiv de 0,01 - 10%, utilizate în determinările ulterioare.
• Cuantificarea apoptozei și necrozei celulelor tumorale în prezența concentrațiilor netoxice de extracte vegetale a indicat niveluri de viabilitate celulară ridicate pentru concentrații de 10% ale soluțiilor apoase de propolis, de 1% pentru extractele de armurariu și rozmarin, de 0,1% pentru extractul de rostopască și pentru tincturile de propolis, de 0,05% pentru extractul de lemn dulce și de 0,01% pentru extractul de cătină roșie.
• Tincturile de propolis și extractele de cătină, rostopască, armurariu, lemn dulce și rozmarin induc o activare a activităţii caspazice globale în celulele tumorale Hep-2. De asemenea, extractele de cătină și de rostopască, precum și combinațiile rostopască-cătină, cătină-lemn dulce, rostopască –lemn dulce și rostopască cătină–lemn dulce induc apariția apoptozei acestor celule, demonstrând potențialul efect antiproliferativ al acestora.
• Evaluarea genotoxicității celor mai active extracte naturale, care au făcut obiectul cererilor de brevet depuse sau care urmează a fi depuse a evidențiat faptul că extractul total de rostopască de concentrație 0,2% a prezentat o capacitate genotoxică crescută, în timp ce extractele de cătină roșie și delemn dulce au prezentat o genotoxicitate scăzută.
• Diseminarea rezultatelor proiectului în anul 2018 s-a realizat prin comunicarea rezultatelor de cercetare în cadrul a 3 conferințe naționale, publicarea a 4 articole ISI, 1 articol BDI, 1 capitol într-o carte publicată în editură internațională, 2 brevete de inventie, 1 workshop final, 2 teze de licență, 2 teze de doctorat.
• În concluzie, obiectivele acestei etape, precum și livrabilele propuse au fost realizate în totalitate.
Bibliografie selectivă
Xxxx X., Int. J. Food Microbiol., 94(3), 223-53,2004 Xxxxx M.M. Clin. Microbiol. Rev. 12(4), 564-82, 1999
Santajit S., Indrawattana N. Biomed. Res. Int.,17, 123-127, 2016 Xxxxxxx E, et al., The Scientific World J., 2014, Article ID 721402, 2014