Contract
โครงการ การสรางแบคทีเรียในลําไสที่สามารถผลิตสารแลคโตเฟอรินและผลตอ
การปองกันการเกิดมะเร็งลําไส หญในหนูขาวทไดรับสารเอซอกซี่มเทนี
โดย ธีระ ชีโวนรินทร และ คณะ
30 มิถุนายน 2549
สัญญาเลขที่ MRG4680071
โครงการ การสรางแบคทีเรียในลําไสที่สามารถผลิตสารแลคโตเฟอรินและผลตอ
การปองกันการเกิดมะเร็งลําไส หญในหนูขาวทไดรบสารเอซอกซี่มเทนี
คณะผูวิจัย สงกัด
1. ดร. ธีระ ชีโวนรินทร ภาควิชาชีวเคมี คณะแพทยศาสตร
มหาวิททยาลัยเชียงใหม
2. รศ.ดร.วัชระ กสินฤกษ ภาควิชาเทคนิคการแพทย คณะเทคนิค
การแพทย หาวิทยาลัยเชียงใหม
สนบสนุนโดยทบวงมหาวิทยาลัย และสํานักงานกองทุนสนับสนุนการวิจยั
บทค ยอ
ในการศึกษาครั้งนไี้ ดสรางแบคทีเรียสายพนธ L. alctis ทสามารถสรา งแลคโตเฟอรรินโดยใสยีน แลคโตเฟอรริน ขนาด 1200, 600 และ 133 คูเบสเขาไปโดยใชพลาสมิด pBE31 ได สายพนธ LF001, LFN002 และ LFC003 และเพื่อใหมีการสรา งแลคโตเฟอรรินที่สรางออกมาในนา้ํ เลี้ยงจึงใสยีนแลคโตเฟอร รินสวน N-lobe ขนาด 600 คูเบสเขาไปโดยใชพลาสมิด pAMJ2008 ได สายพันธ ALFN เมื่อตรวจสอบการ แสดงออกโดย Western blot analysis โดยใช anti-human lactoferrin antibodies พบวาสามาถตรวจวัด โปรตีนแลคโตเฟอรรินไดในสายพนธ L. lactis LF001 แตไมสามารถตรวจพบไดในอีกสองสายพันธ และไม สามารถตรวจหาโปรตีนในน้ําเลี้ยงได เมื่อดูการแสดงออกของยีนโดยการวัดการสราง mRNA จากยีนแลค โตเฟอรริน โดยใข cDNA probe ของยีนแลคโตเฟอรริน พบวามีการแสดงออกใน L. lactis สายพันธ LF001 และ ALFN เทานั้น จึงใชสองสายพันธุนี้ในการศึกษาฤทธื์การตานรอยโรคเริ่มตนของการเปนมะเร็งลําไส ใหญในหนูขาว
เมื่อทดสอบฤทธิ์การตานiรอยโรคเริ่มตนกอนมะเร็งลําไสใหญ (aberrant crypt foci ; ACF) ในหนู ขาวที่ไดรับสารกอมะเร็งลําไสใหญไ ดเมธิลไฮดราซีน (dimethylhydrazine; DMH) ในระยะเริ่มตน พบวาหนู ที่ไดรับ L.lactis จะมีจํานวน aberrant crypt foci มากกวาหนูที่ไดรับเฉพาะ saline และเมื่อเปรียบเทียบ ระหวาง L. lactis ที่ใสยีนแลคโตเฟอรรินเขาไป (LF001 และ ALFN) พบวาสามาถลดจํานวน ACF ไดเมื่อ เทียบกับ L. lactis ที่ใสเฉพาะพลาสมิด (BE31 และ AMJ2008 ตามลําดับ) และยงั สามารถลดจํานวน ACF ที่มีขนาดมากกวา 3 Ac/f โดยเฉพาะหนูที่ได L. lactis สายพันธุ ALFN สามารถลดจํานวน ACF และ ACF ที่ มีมากววา 3 Ac/f ไดอยางมีนัยสําคัญ (p<0.05) เมอวดั ปริมาณแอโรบิคแบคทีเรียในอุจาระของหนูที่ไดรับ แบคทีเรียของแตละสายพนธุพบวาไมมีความแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญตลอดการทดลอง ซึ่งกลไกการ ปองกันการเกิด ACF ในหนูขาวที่ไดรับไดเมธิลไฮดราซีน จะไดมีการศึกษาตอไป
เมื่อทดสอบในระยะสงเสริม L. lactis ทใี่ สยีนแลคโตเฟอรรินเขาไป (LF001 และ ALFN) มีแนวโนม ที่จะลดจํานวน ACF และ ACFที่มีขนาดมากกวา 3 Ac/f ไดเมื่อเทียบกับ L. lactis ที่ใสเฉพาะพลาสมิด (BE31 และ AMJ2008 ตามลําดับ) แตไมพบวามีความแตกตางอยางมีนัยสําคัญ
Abstract
In this study, we constructed lactoferrin-producing, lactic acid bacteria, Lactococcus lactis by introducing several size lactoferin genes (1200 bp, 6000 bp and 133 bp) to L. lactis MG1363 using pB31 plasmid generated strain LF001, LFN002, LFC003 respectively. To increase the production of lactoferrin in culture media, 600 bp of N-lobe LF gene was inserted to pAMJ2008 generated ALFN. The recombinant lactoferrin was detected by Western blot analysis using anti- human antibodies. The recombinant lactoferrin was only detectable in the cell of L. lactis LF001 but not in other strains and culture supernatant. However, the mRNA expression human lactoferrin or fragment was detectted in strain LF001 and ALFN by Northern blot hybridization with N-lobe hLF cDNA probe. Therefore, we selected L. lactis LF001 and ALFN for anti-colon carcinogenesis determination.
We determined the modulating effect of L. lactis LF001 and ALFN on the aberrant crypt foci formation in colon of rat received colon carcinogen, dimethylhydrazine; DMH. The results showed that rat received L.lactis exhibited the high number of ACF when compared to control (saline) group. In initiation stage L. lactis harboring lactoferrin gene (LF001 and ALFN) can decrease the number of ACF and ACF which has more than 3 Ac/f in DMH treated rat colon compared to L. lactis harboring each empty vector (BE31 and AMJ2008, respectively). The rat received L. lactis LFN exhibited the significantly low number of ACF and ACF which has more than 3 Ac/f compared to strain AMJ2008 (p<0.05). In addition, there was no significantly different between the number aerobic bacteria from feces of rat treated with DMH treated and L. lactis each strain in the initiation stage. The mechanisms of modulating effects of lactoferrin producing L. lactis on DMH induced colon carcinogenesis would be further study.
In the promotion stage, L. lactis harboring lactoferrin gene (LF001 and ALFN) trended to decrease the number of ACF an ACF which has more than 3 AC/f when compared to each empty plasmid strain (BE31 and AMJ2008, respectively), but there was no statistical difference.
Executive summary
ในปจจุบันโรคมะเร็งลําไสใหญเปนสาเหตุการตายทสี่ ําคญเปนอนดับ 3 ในเพศชายและอันดับ 5 ใน เพศหญิงของผูปวยโรคมะเร็งในประเทศไทย สาเหตุหลักอาจเนื่องมาจากความผิดปกติทางพันธุกรรมและ หรือการไดรับสารกอมะเร็งจากสิ่งแวดลอมรวมกับการรับประทานอาหารทไมสมดุล การรักษาโรคมะเร็ง ลําไสนั้นตองใชคาใชจายสูงและอัตราการรอดชีวิตต่ําดังนนการปองกันการเกิดโรคมะเร็งเจึงปนวิธีที่ดีกวา การรกษาโรคมะเร็งไดซึ่งปจจุบันมีการใชสารเคมีปองกัน (chemopreventive agents) จากผลิตภัณฑ ธรรมชาติหลายชนิดในการปองกนมะเร็งลําไสใหญในสตวทดลอง ซึ่งการใชสารสกัดจากธรรมชาติจะตองมี การใชสารสกัดในปริมาณมากและใชเวลานานจึงจะเห็นผล ดงนั้นจึงมีการพัฒนาวิธีการใหสารตานมะเร็ง อยางมีประสิทธิภาพมากขึ้น
แบคทีเรียในลําไสมีบทบาทรวมตอการเกิดมะเร็งลําไสใหญ เนื่องจากแบคทีเรียสามารถสัมผัสกับ เยอบุผนังลําไสโดยตรงเปนเวลานานและสามารถสรางสารกอการกลายและสารกอมะเร็งไดโดยตัวมันเอง หรือดูดซับสารพิษจากอาหารไวบนผนังเซลลของมัน การปรับปรุงสายพันธของแบคทเรียในลําไสใหมีผล ปองกันการเกิดมะเร็งลําไสใหญหรือใหแบคทีเรียในลําไสเปนผูผลิตสารตานมะเร็งลําไสใหแกคนจึงเปน สมมุติฐานที่ไดเสนอขึ้นมา เนื่องจากยังไมพบรายงานวาแบคที่เรียที่อาศัยอยูในลําไสจะสามารถผลิตสาร ตานมะเร็งลําไสไดการสรางแบคที่เรียในลําไสโดยการใสยีนจําเพาะทสามารถผลิตสารที่มีประโยชนเหลานี้ แลวใหมีการสรางอยางตอเนื่องในลําไสจึงอาจจะเปนวิธีการที่ทําใหมีสารตานมะเร็งเพื่อการปองกันมะเร็ง ลําไสใหญไดอยางมีประสิทธิภาพยิ่งขึ้น
การทดลองนี้มีวัตถุประสงคเพื่อที่จะเพื่อสรา งแบคทีเรียในลําไสในกลุมของ Lactococcus lactis ให
สามารถผลิตแลคโตเฟอรินโดยใชเทคนิคทางพันธุวิศวกรรม และทดสอบฤทธิ์ของ recombinant bacteria ที่ สรา งขึ้นตอการเกิดมะเร็งลําไสในหนูขาวที่ไดรับสารไดเมธิลไฮดราซีน (Dimethylhydrazine; DMH) การ ทดลองนไี้ ดสรางพลาสมิดเพื่อที่จะใชในการโคลนยีนที่สรางแลคโตเฟอรรินเขาสูแบคทีเรีย Lactococcus lactis โดยแบงเปนการโคลนยีนแลคโตเฟอรินเขา ไปใน Lactococcus lactis โดยพลาสมิด pBE31 ได L. lactis สายพันธุ LF001 LFN002 และLFC003 ตามลําดับ รวมทั้งสายพนธที่ใสพลาสมิดเปลา ๆ คือ L. lactis BE31 (pBE31) และ pAMJ2008 ได ALFN จาการศึกษาแบคทีเรียของแตละสายพันธุพบวาพลาสมิด ที่มียีนแลคโตเฟอรินสามารถที่จจะเพิ่มจํานวนและมีความเสถียรในเซลลของ L. lactis และเมื่อดูคุณสมบัติ พื้นฐานของ L. lactis แตละสายพันธพบวา L. lactis MG1363 ที่เจริญในใน M17-G โดยปราศจาก Erythromycin นั้นจะมีการ L. lactis MG1363 เจริญเติบโตอยางรวดเร็วกวา L. lactis ที่เจริญเติบโตใน M17-G5 ที่มียาปฏิชีวนะ Erythromycin และใน L. lactis ที่มียีนแลคโตเฟอรรินทั้ง 3 ขนาด ไดแก LF001, LFN002 และ LFC003 จะมีการเจริญเติบโตที่ชากวาสายพนธ BE31 ที่เปนพลาสมิดเปลา เมื่อวัด pH ของ น้ําเลี้ยงพบวา pH ของน้ําเลี้ยงจะลดลงจากประมาณ 7.5 ในตอนเริ่มตนจนถึงประมาณ 6.0 เมื่อถึง stationary phase ซึ่งจะสัมพันธกับการเจริญเติบโตของแบคทีเรียทุกสายพันธุ ซึ่งแสดงใหเห็นวาการใส พลาสมิดแตละชนิดเขาไปไมไดรบกวนขบวนการสรางกรดแลคติคของแบคทีเรียเจาบาน
เมื่อทําการศึกษาผลของแบคทีเรียที่สรางขึ้นตอการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย E.coli พบวา เมื่อ เลี้ยง L. lactis ทุกสายพันธรวมกับ E. coli JM109 ทําให E. coli ไมสามารถเจริญเติบโตไดเนื่องจาก
L. lactis เมื่อเจริญถึง stationary phase จะทําใหน้ําเลี้ยงมีความเปนกรดโดยมีคา pH อยูประมาณ 5.5 –
6.0 ซึ่งรบกวนการเจริญเติบโตของ E. coli ซึ่งเปนคุณสมบัติของ lactic acid bacteria ทําใหไมสามารถเห็น
ผลแตกตางระหวาง L. lactis สายพนธเุ ดิมก ที่ใสยีนแลคโตเฟอรรินได ซึ่งจะตองมีการออกแบบการ
ทดลองเพื่อศึกษาหาผลของแบคทีเรียที่มียีนแลคโตเฟอรรินตอการเจริญเติบโตอขง E. coli ในหลอดทดลอง ในการทดสอบหาการแสดงออกของยีนแลคโตเฟอรรินโดยการตรวจหาแลคโตเฟอรรินที่แบคทีเรีย
สรงขึ้นโดยวิธี Western blot (Rabbit anti-human lactoferrin antibody) พบวาไมสามารถตรวจพบแลคโต เฟอรรินในน้ําเลี้ยงของทุกสายพันธ แสดงวาแลคโตเฟอรรินที่สรา งขึ้นในเซลลของแบคทีเรียโดยวิธีนี้ไมมี ระบบที่จะหลั่งโปรตีนที่สรา งขึ้นออกมาในนา้ํ เลี้ยง เมื่อตรวจหาโปรตีนภายในเซลลสามารถตรวจหาแลต โตเฟอรินไดใน L. lactis สายพันธุ LF001 มีขนาดประมาณ 80 กิโลดาลตันแตไมสามารถตรวจพบในอีก 3 สายพนธุคือ LFN002, LFC003 และ ALFN ซึ่งโปรตีนที่สรางไดอาจจะมีขนาดเล็กหรืออาจสูญเสียคุณสมบัติ การเปนแอนติเจนตอแอนติบอดีสที่ใชจึงตองมีการพฒนาวิธีการตรวจสอบ อยางไรก็ตามสามารถตรวจสอบ การแสดงออกของยีนใน L. lactis สายพันธ LF001 และ ALFN โดยการตวจหา mRNA ดวยวิธี Northern blot hybridization โดยใช lactoferrin cDNA เปน probe สําหรับติดตามจึงเลือกใช L. lactis สองสายพันธุนี้ ในการศึกษาหาฤทธิ์การตานการเกิดรอยโรคเริ่มตนของการเกิดมะเร็งลําไสใหญ (aberrant crypt foci; ACF) ในหนูขาวที่ไดรับไดเมธิลไฮดราซีน (Dimethylhydrazine; DMH)
ในการศึกษาฤทธิ์การตานการเกิดรอยโรคเริ่มตนของการเกิดมะเร็งลําไสใหญ (aberrant crypt foci; ACF) ในหนูขาวที่ไดรับไดเมธิลไฮดราซีน (Dimethylhydrazine; DMH) จะใช หนู Wistar อายุ 4 สัปดาห โดยปอน L. lactis สายพันธุตาง ๆ จํานวน 1010 CFU ตอตัวตอวัน 1 สัปดาห ในกลุมทดลองจะ ไดรับการฉีด DMH สับดาหละครั้งเปนเวลา 2 ครงปริมาณ 40 มก./กก. น้ําหนักตัว สวนกลุมควบคุมจะไดรับ การฉีด Saline จากนั้นปอนตอไปอีก 3 สัปดาห สวนการศึกษาในระยะสงเสริมหนูจะไดรับ L. lactis สาย พนธุตาง ๆ หลังจากฉีด DMH 40 มก./กก. ไปแลว 2 สปั ดาหแลวปอนตอไปจนสัปดาหที่ หนูทั้งหมดจะถูก ฆาเพอแยกลําไสและนับปริมาณและขนาดของ aberrant crypt foci ในแตละสัปดาหจะเก็บอุจาระจากหนูแต ละกลุม นํามาหาจํานวนแอโรบิคแบคทีเรียโดยละลายและเจื่อจางใน saline และใหเจริญบน LB plate ที่ 37 oซ (L. lactis จะไมเจริญบน LB plate ที่ 37 oซ) โดยคํานวนเปน CFU/กรมอุจาระ
ในการศึกษาระยะเริ่มตนพบวาหนูทุกกลุมมีน้ําหนักที่ไมแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญตลอดการ ทดลอง และไมพบ aberrant crypt foci ในหนูกลุมที่ไดรับการฉีด saline เมื่อเปรียบเทียบในกลมุ ที่ไดรับ DMH (คาเฉลี่ย 249.0+79.1) หนูที่ไดรับ L. lactis ทุกสายพันธจะพบจํานวน ACF มากกวาหนูที่ไดรับการ ปอน saline สวนหนูที่ไดรับ L.lactis ที่มียีนแลคโตเฟอรริน (L. lactis LF001) จะมีจํานวน ACF ลดลง
19.5 % เมื่อเทียบกับ L.lacts ที่ใสเฉพาะ พลาสมิด (BE31) และ โดยเฉพาะหนูทไี่ ด L. lactis สายพันธุ ALFN สามารถลดจํานวน ACF และ ACF ที่มีมากววา 3 Ac/f ไดอยางมีนัยสําคัญ เมื่อเทียบกับหนูที่ ไดรับการปอน L. lactis AMJ2008 (46.6% และ 68% ตามลําดับ; p<0.05) เมื่อวัดปริมาณแอโรบิค แบคทีเรียในอุจาระของหนูที่ไดรับแบคทีเรียของแตละสายพันธุพบวาไมมีความแตกตางกันอยางมีนัยสําคัญ ตลอดการทดลอง ซึ่งกลไกการปองกันการเกิด ACF ในหนูขาวจะไดมีการศึกษาตอไป สวนการทดสอบใน
ระยะสงเสริมมีแนวโน ที่จะใหผลเชนเดียกันกับระยะเริ่มตน โดยที่หนูทไี่ ดรับ L.lactis ที่มียีนแลคโตเฟอรริน
(L. lactis LF001) จะมีจํานวน ACF และ ACF ที่มีมากววา 3 Ac/f ลดลง 27.0 % เและ 32.4% 9ตาม ลําดับมื่อเทียบกับ L.lacts ที่ใสเฉพาะ พลาสมิด (BE31) แตในดานหนูที่ได L. lactis สายพันธุ ALFN สามารถลดจํานวน ACF ไดเพียง 13.7% เมอเทียบกับหนูที่ไดรับการปอน L. lactis AMJ2008 และไม
พบความแตกตางของจํานวACF ที่มีมากกวา 3 AC/f ระหวางสองกลมนี้ แสดงใหเห็นวา L. lactis ท แลคโตเฟอรินจะไมแสดงผลในระยะสงเสริมซึ่งตองมีการศึกษากลไกตอไป
ราง
วัตถุประสงคของโครงการ
1. เพื่อสราง Lactococcus lactis ที่มียีนของแลคโตเฟอรริน
2. เพอื่ ทดสอบคุณสมบัติของแบคทีเรียที่สรางไดและทดสอบคุณสมบัติของ recombinant lactoferrin ที่ สรางได
3. เพ ทดสอบฤทธิ์ของแบคทีเรียแตละ สายพันธตอการยับยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย E. coli ใน
หลอดทดลอง
4. เพอื่ ทดสอบฤทธิ์ของแบคทีเรียแตละสายพันธตอการยับยั้งการเกิด aberrant crypt foci ในหนูขาวที่ ไดรับสารกอมะเร็งลําไสเอซอกซีมีเทน ในระยะเริ่มตน
5. เพอื่ ทดสอบฤทธิ์ของแบคทีเรียแตละสายพันธตอการยับยั้งการเกิด aberrant crypt foci ในหนูขาวที่ ไดรับสารกอมะเร็งลําไสเอซอกซีมีเทน ในระยะสงเสริม
ผังการดําเนินการวิจัย
สรางพลาสมิดเพื่อพาแล็คโตเฟออรินเขาสู L. lactis
โคลนพลาสมิดที่สรางเขาสู L. lactis
ตรวจสอบยีนทมี่ ีอยูในเซลล L. lactis แตละสายพนธุ
ตรวจสอบลักษณะของ Recombinant bacteria
ตรวจสอบการแสดงออกของยีนโดย
Western blot analysis
ตรวจสอบการแสดงออกของยีนโดย
Northern blot hybridization
ตรวจสอบผลของ lactoferrin producing L. lactis
ตอการเจริญ ของ E.coli
ตรวจสอบผลของ lactoferrin producing L. lactis
ตอการเกิดรอยโรคเริ่มตนมะเร็งลําไสใหญในหนูขาว ที่ไดรับสารกอมะเร็ง
การดําเนินการวิจัย
1. การสรางพลาสมิดเพื่อพาแลคโตเฟอรินยีนเขาสู Lactococcus lactis
1.1 การโคลนแลคโตเฟอรินยีนเขาสูพลาสมิด pBE31 โดยตรง
พลาสมิด pBE31 , Lactococcus lactis YIT2081 ไดรับจาก Dr. Tomomi Kuwahara จาก Department of Bacteriology School of Medicine The University of Tokushima, Japan สวน human lactoferrin (subclone ในพลาสมิด pSKLF) ไดรับจาก Dr. Dae-Yeul Yu จาก Korea Research Institute of Bioscience&Biotechnology, Korea
pBE31 และ pSKLF จะถูกยอยดวยเอ็นไซม Xba I และ Kpn I (Pomega) จากนันจึงแยกชิ้นสวนที่ ถูกยอยมาทําการเชื่อมกนโดยเอ็นไซม T4 ligase (Promega) (จากแผนภาพรูปที่ 1.1) จากนั้นนําไปโคลน เขาใน E.coli HB101 เพื่อเพิ่มจํานวนจากนั้นสกัดพลาสมิดดีเอ็นเอจาก E.coli เพื่อนํามาตรวจดูยีน lactoferrin โดยวิธี PCR พบวาสามาถพบ amplicon ขนาด 2.2 กิโลเบสซึ่งเปนขนาดของยีนแลคโตเฟอรริน (รูปที่ 1.2) ใหชอวา pBLF001
Ba Sm Ec
pSKLF 2.9
hLF
Ap
Xba I
mH I a I oR I
Xba I / Kpn I
EcoR I Hind III Cla I Xho I Kpn I
ยอยดวย XbaI / KpnI
Xba I
pBE31
LacZ
Kpn I
Tcr
รูปที่ 1.1 แผนภาพการโคลนแลคโตเฟอรินยีนเขาสูพลาสมิด pBE31 โดยตรง
2200
2000
hLF (2.2 KB)
รูปที่ 1.2 เลนที่ 1 λ Hind III marker เลนที่ 2 PCR product ขนาด 2.2 กิโลเบสเมื่อใช pBLF001 เปน template แล ใชprimer LFF 5’-GTGTCCATGGCCGTAGGAGAA GGAGTGTTCA G-3’ และ LFR 3’-GGACACTTAAG GAGTCCTTCATTAGACTCTTTGGTtGT-5’
1.2 เชื่อมยีนแลคโตเฟอริน N-lobe และแลคโตเฟอริซินก
(SP) เพอเพิ่มการสงผลิตภัณฑที่ไดออกนอกเซลล
promoter และ signal peptide
ยีนของ human lactoferrin จะถูกนําไปเชอมตอกับ promoter ของ ยีน CcpA ของ Lactococcus lactis เพื่อเพิ่มความสามารถในการสรางแลคโตเฟอรินในเซลล โดยแบงเปน 2 สวนคือ lactoferrin N-lobe (ขนาด 730 bp) และ lactoferricin (ขนาด 133 bp) ดังรูปที่ 1.3
-167 1 730
N-lobe of lactoferrin
PCcpA N-LF
-167 1 133
Human lactoferricin
PCcpA Lfn
รูปที่ 1.3 แผนภาพการเชอมตอ lactoferrin N-lobe และ lactoferricin เขากับ CcpA promoter
เมื่อ amplify ยีน CcpA promoter โดยใช genomic DNA ของ Lactococcus lactis เปน template และ ใช Primer 2 ชนิดคือ CCPF : 5’ – ACA ACT CTA GAT CCA TTC TAC GCT ATT TTT – 3’ และ CCPR : 5’
– GTT GTG AAT TCT TCT ACC ATG GTT GGC TAT CCT C – 3’ โดยมี Xba I NcoI และ EcoR I เปน
subcloning site และได amplify ยีนของ human lactoferrin และ lactoferricin โดยใช pSKLF เปน template และ ใช primer LFF : 5’-GTGTCCATGGCCGTAGGAGAA GGAGTGTTCA G-3’ กับ LFNR: 5’ – GCA TGG AAT
TCT TAC CGG GCC AGA TGG – 3’ สําหรับ lactoferrin N-lobe และ LFF: 5’-GTGTCCATGGCCGTA GGAGAA GGAGTGTTCA G-3’ LFcR: 5’ – TTT TCG AAT TCT TAC TGG ATA CAC TGG – 3’สําหรับ
lactoferricin โดยไดเพิ่มสวนของ Nco I และ EcoR I site เขาไปเพื่อเชื่อมก สวน Promoter ใน plasmid จากนั้น
ก็โคลนเขาใน E.coli HB101 เพื่อเพมจํานวนจากนั้นสกัดพลาสมิดดีเอ็นเอจาด E.coli เพื่อนํามาตรวจดูยีน lactoferrin โดยวิธี PCR พบวาสามาถพบ amplicon ขนาด 730 basepair ซึ่งเปนขนาดของยีน lactoferrin N-lobe ใหชื่อวา pBLF002 (LF-N-lobe) และ amplicon ขนาด 133 basepair ซึ่งเปนขนาดของยีน lactoferricin (รูปที่ 1.4) ใหชื่อวา pBLF003 (lactoferricin) ตามลําดับ สามารถสรุปผลการสรางพลาสมิดและคุณสมบัติของพลาสมิด ที่จะนําไปขนถายเขาสู Lactococcus lactis ดังตารางที่ 1.1
1000 730 bp
500
133 bp
รูปที่ 1.4 Lactoferrin (N-lobe) และ lactoferricin amplicon : เลนที่ 1 DNA 100 basepair markers เลนที่
2 PCR product ขนาด 730 bp เมื่อใช pBLF002 เปน template และ ใชprimer LFF 5’- GTGTCCATGGCCGTAGGAGAA GGAGTGTTCA G-3’ และ LFNR 5’ – GCA TGG AAT TCT TAC CGG GCC AGA TGG – 3’ เลนที่ 3 PCR product ขนาด 730 bp เมื่อใช pBLF003 เปน template และ ใชprimer LFF 5’-GTGTCCATGGCCGTAGGAGAA GGAGTGTTCA G-3’ และ LFcR: 5’ – TTT TCG AAT TCT TAC TGG ATA CAC TGG – 3’
ตารางที่ 1.1 คุณสมบัติพลาสมิดเพ ทจะใชี่ ในการผลิตแลคโตเฟอรินใน L. lactis
pBE31 pUC ori+, AMB1 ori+, LacZ+ , Emr
pBLF001 pBE31 + full length human lactoferrin (2.2 KB)
pBLF002 pBE31 + CcpA promoter + human lactoferrin N-lobe (730 bp) pBLF003 pBE31 + CcpA promoter + human lactoferricin (133 bp)
2. การโคลนพลาสมิดท รางขนเขาสึ้ ู Lactococcus lactis
การเตรยม Competent cell ของ L. lactis
Lactococcus lactis สายพันธุ MG1363 ไดรับจากบริษัท Bionere ประเทศเดนมารค เปน ชนิด Prophage-cure และไมมีพลาสมิดภายในเซลล (plasmid free) ซึ่งปรับปรุงสายพันธุมาจาก L. lactis subsp. Cremonis NCDO712 เปนแบคทีเรียที่ผลิตกรดแลคติก และมีการใชในอุตสาหกรรมอยางแพรหลาย สามารถเพาะเลี้ยงในอาหารเลยงเชื้อ M17 (ของบริษัท Merck ประเทศเยอรมัน)
เตรียมเลี้ยง L. lactis MG1363 ในอาหารเลยงเชื้อ M17-G5 ขามคืนที่ 30 oซ โดยไมตองเขยา จากนั้นนําไป enoculate ใน M17 ที่มี 1% glycine , 17 % sucrose และ 0.5 % glucose ปริมาตร 100
มล. บมที่ 30 oซ จนได
4 oซ จากนั้นลางเซลลด
า OD600 เทากับ 0.4-0.7 ทําการเก็บเซลลโดยการปนเหวี่ยงที่ 5000 g 10 นาที ที่ วยสารละลาย 17 % sucrose ที่มี 10% glycerol (สารละลาย 1) ปนเหวี่ยงที่ 5000
g 10 นาที ที่ 4 oซ จากนั้น suspend เซลลที่ไดในสารละลาย 1 ที่เย็นปริมาตร 1 มล. ใชเซลลปริมาตร 40
ไมโครลิตรในการ transformation แตละครั้ง
การถายพลาสมิดเขาสู L. lactis โดย electroporation
ทําการผสม competent cell 40 ไมโครลิตรกับพลาสมิดดีเอ็นเอ 0.1-1 ไมโครกรัม จากนั้นถายลงสู cuvette สําหรับ electroporation (ขนาด 0.2 cm) วางบนน้ําแข็ง ทําการ electroporation ที่ 25 mF, 2 kV, 200 ohm จากนั้นเติมอาหาร M17-SGCaMg (M17 ที่มี sucrose 17%, glucose 0.5% , CaCl2 2 mM และ MgCl2 20 mM) ปริมาตร 960 ไมโครลิตร ลงใน cuvette นําไปบมที่ 30 oซ เปนเวลา 2 ชั่วโมงแบงเซลลมา spread บน M17-SGCaMg Agar ที่มี Erythromycin 1 ไมโครกรัม/มล. เลี้ยงใว 1 –2 วัน นําโคโลนีที่ไดมา แยกใหเปนโคโลนีเดยว แลวเลือกมาเพอตรวจสอบหาพลาสมิดและและโตเฟอรินยีนในเซลลของ L. lactis ที่ ถูก trransform เขาไป สายพันธของ L. lactis ที่ไดแสดงดังตารางที่ 2.1
ตารางที่ 2.1 สายพนธของ L. lactis ท รางขึ้นในการทดลองน
L. lactis MG1363 Prophage-cure and plasmid free
L. lactis BE L. lactis MG1363 ท พลาสมิด pBE31 เปน vector control
L. lactis LF001 L. lactis MG1363 ที่ทีพลาสมิด pBLF001 (full length human lactoferrin )
L. lactis LFN002 L. lactis MG1363 ที่ทีพลาสมิด pBLF002 (human lactoferrin N-lobe (730 bp))
L. lactis LFC003 L. lactis MG1363 ท พลาสมิด pBLF003 (human lactoferricin (133 bp))
3. การตรวจสอบหาพลามิดและยีนแลคโตเฟอรินที่ใสเขาไปใน L. lactis
เลือกโคโลนีของ L. lactis แตละสายพันธ (4 สายพันธุได ก BE31 LF001, LF002 และ LF003) ที่
เจริญบน erythromycin มา enoculate ใน M17-G5 ปริมาตร 10 มล. บมที่ 30 oซ ขามคืน จึงไดนําไปแยก หาพลาสมิดของแตละสายพนธุโดยนําน้ําเลยงขามคืนมาแยกเซลลแบคทีเรียโดยการปนเหวี่ยงที่ 5000 g 15
นาที 4 oซ จากนั้นละลายตะกอนเซลลในสารละลาย sucrose 25% ที่มี Lysozyme 30 มก./มล. ปริมาตร 200
ไมโครลิตร บมที่ 37 oซ 15 นาทีจากนนเต
สารละลาย alkaline SDS ( 3%SDS ใน 0.2 M NaOH) ปริมาตร
300 ไมโครลิตรผสมใหเขากันตงั้ ทิ้งไวที่อุณหภูมิหอง 5 นาที เติมสารละลาย 3 M sodium acetate pH 4.8
ปริมาตร 300 ไมโครลิตรเขยาใหเขากัน นําไปปนแยกตะกอนที่ 15000 g 15 นาที ที่ 4 oซ นําสวนใสมาใส หลอดใหม ตกตะกอนดวย isopropanol 650 ไมโครลิตร นําไปปนแยกตะกอนที่15000 g 15 นาที ที่ 4 oซ ละลายตะกอนในนา้ํ ปริมาตร 320 ไมโครลิตร เติม 7.5 M ammonium acetate ที่มี ethidiumbromide 0.5 มก./มล 200 ไมโครลิตร ผสมใหเขากันเติม Phenol: chloroform (5:1) ปริมาตร 350 ไมโครลิตร ผสมใหเขา กัน
6557 bp
4361 bp
2322 bp
2027 bp
1 2 3 4 5
รูปที่ 3.1 พลาสมิดทแี่ ยกไดจาก L. lactis แตละสายพันธ BE31 lane 2 ; LF001 lane 3; LF002 Lane 4; LF003 lane 5 และ λ Hind III marker lane 1
นําไปปนเหวยงท15000 g 15 นาที ที่ 4 oซ ดูดเอาสวนบนมาใสหลอดใหม เติมเอธานอลที่เย็น 1 มล. ผสมใหเขากัน นําไปปนแยกตะกอนที่15000 g 15 นาที ที่ 4 oซ ลางตะกอนดวนเอธานอล 70 % ทิ้งใวให แหง ที่อุณหภูมิหองละลายใน TE buffer ปริมาตร 30 ไมโครลิตร นําไปทํา electrophoresis โดยใช 0.7% agarose gel ผลที่ไดแสดงดังรูปที่ 3.1
จากรูปที่ 3.1 จะแสดงใหเห็นวาพลาสมิด pBE31 และพลาสมิดที่มียีนแลคโตเฟอรินสามารถที่จจะ replicate และมีความเสถียรในเซลลของ L. lactis สายพันธ MG1363 ซึ่งสามารถสกัดพลาสมิดจากแตละสาย พันธโดยสกัดได pBE31 ขนาด 5.3 KB จากสายพันธ BE31 pBLF001 ขนาด 7.5 KB จากสายพันธ L.lactis 001 pBLF002 ขนาด 6.2 KB จากสายพันธ L.lactis 002 และ pBLF003 ขนาด 5.5 KB จากสายพันธ L.lactis 003
เมอตรวจสอบดูยีนของแลคโตเฟอรรินในพลาสมิดทสกัดไดจาก L.lactis สายพันธุตาง ๆ โดยการ amplify ยีนขนาดตาง ๆ ของ lactoferrin โดยวิธี PCR เมื่อใชพลาสมิดที่สกัดไดจากแตละสายพนธุ พบวาสา มาถพบ amplicon ขนาด 2200 basepair ซึ่งเปนขนาดของยีนแลคโตเฟอรรินขนาด (รูปที่ 3.2a) ขนาด730 basepair ซึ่งเปนขนาดของยีน lactoferrin N-lobe (รูปที่ 3.2b) และ amplicon ขนาด 300 basepair ซึ่งเปน ขนาดของยีน lactoferricin เชื่อมกับ CcpA promoter (รูปที่ 3.2c)
a) 1 2 3 b)
L.lactis LF001
1 2 3
L.lactis LF002
c) 1 2 3
L.lactis LFC003
รูปที่ 3.2 Amplicon ของ Lactoferrin (2.2 KB), Lactoferrin (N-lobe) และ lactoferricin โดยใชพลาสมิดที่สกัดได จาก a) L. lactis สายพันธุ LF001 เปน template และ ใช primer LFF:5’-GTGTCCATGGCCGTAGGA GAAGGAG-3’ และ LFR: 5’-GGTTTGAATTCTTACTTCCTGAGGAAT-3. b) L. lactis สายพันธุ
LF002 เปน template และ ใชprimer CCPF 5’-ACAACTCTAGATCCATTCTACG CTATTTTT-3’ และ
LFNR 5’ – GCA TGG AAT TCT TAC CGG GCC AGA TGG – 3’ ) L. lactis สายพันธุ LF003 เปน
template และ ใชprimer CCPF 5’- ACAACTCTAGATCCATTCT ACGCTATTTTT G-3’ และ LFcR: 5’ – TTT TCG AAT TCT TAC TGG ATA CAC TGG – 3’: โดยเลนที่ 1 ของแตละรูปจะเปน DNA 100 basepair markers และเลนที่ 2 จะเปน template ทสกัดจาก L.lactis สายพันธุ BE31
4. การทดสอบคุณสมบัติของ Recombinant bacteria ท รางได
เม ทําการศึกษาถึงคณสมบัติโดยทั่วไปของ L.lactis ที่ใสพลาสมิดแตละชนิดเขาไป ซึ่งคุณสมบัติ
ของ L. lactis นั้นจะหลงกรดแลคติคซงเปนผลิตภัณพของเซลลออกมาเมอเซลลเจริญถึง stationary phase จึงทําการตรวจสอบการเจริญเติบโตของ L. lactis แตละสายพันธโดยการวัดความขุนที่ OD600 โดยทําการ enoculate น้ําเลยงขา มคืน 1 มล. ใน M17-G5 ปริมาตร 50 มล (1:5) จากนั้นวัด OD600 ทุก ๆ ชั่วโมงและ ทําการวดั pH ของน้ําเลี้ยงของแตละสายพันธุโดยกระดาษ Universal indicator ไดผลดังแสดงในตารางที่
4.1 และรูปที่ 4.1
ตารางที่ 4.1 แสดง pH ของน้ําเลี้ยงของแตละสายพันธ
pH ของน้ําเลี้ยง
สายพันธ | กอนเลี้ยง | 2 ชม. | 3 ชม. | 4 ชม. | 5ชม. | 6 ชม. | 7 ชม. | 12 ชม. | |
L. lactis MG1363 | 7.5 | 7.5-7 | 6.5 | 6.5 | 6 | 6 | 6 | 6 | |
L. lactis BE | 7.5 | 7.5-7 | 6.5 | 6.5 | 6.5-6 | 6 | 6 | 6 | |
L. lactis LF001 | 7.5 | 7.5-7 | 7 | 7-6.5 | 6.5 | 6 | 6 | 6 | |
L. lactis LFN002 | 7.5 | 7.5 | 7 | 7 | 7 | 6.5 | 6.5 | 6 | |
L. lactis LFC003 | 7.5 | 7.5 | 7 | 7 | 7 | 6.5 | 6.5 | 6 |
L. lactis MG1363
L. lactis BE31
L. lactis LF001
L. lactis LFN002
L. lactis LFN003
1.40
1.20
1.00
OD 600
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
0 2 4 6 8 10 12 14
เวลา (ชวั่ โมง)
รูปที่ 4.1 แสดงอัตราการเจริญเติบโตของ L. lactis สายพันธุ MG1363 (เซลลเจาบาน เจริญเติบโตใน M17- G5 โดยปราศจาก Erythromycin) BE31, LF001, LFN002 และ LFC003 ตามลําดับ เจริญเติบโตใน M17- G5 ที่มี Erythromycin 1 ไมโครกรัม/มล.)
จากรูปที่ 4.1 และตารางที่ 4.1 จะแสดงใหเห็นวา L. lactis MG1363 ที่เจริญในใน M17-G โดย ปราศจาก Erythromycin นั้นจะมีการเจริญเติบโตอยางรวดเร็วกวา L. lactis ทเจริญเติบโตใน M17-G5 ที่มี
Erythromycin 1 ไมโครกรัม/มล. และใน L. lactis ที่มียีนแลคโตเฟอรรินทั้ง 3 ขนาด ได ก LF001, LFN002
และ LFC003 จะมีการเจริญเติบโตที่ชากวาสายพันธ BE31 ที่เปนพลาสมิดเปลาและพบวาสายพันธุ LFN002 มีการเจริญเติบโตชาที่สุด ซึ่งอาจจะเปนไปไดวาเนองจากเซลลจะตองมีการสราง recombinant protein ในขณะที่เซลลมีการเจริญเติบโตจึงทําใหการเจริญเติบโตมีอัตตราที่ชากวาเซลลที่ไมไดใสพลาสมิด หรือที่ใสพลาสมิดเปลา แตก็สามารถเจริญเติบโตไดจนถึง stationary phase ไดเชนเดียวกัน เมื่อตรวจดูการ สรา งกรดแลคติกของแบคทีเรียแตละสายพันธพบวา pH ของน้ําเลี้ยงจะลดลงจากประมาณ 7.5 ในตอน เริ่มตนจนถึงประมาณ 6.0 เมอถึง stationary phase จะสัมพันธกับการเจริญเติบโตของแบคทีเรียทุกสาย พันธุ จากการวัด pH ของนา้ํ เลี้ยงแสดงใหเห็นวาการใสพลาสมิดแตละชนิดเขาไปไมไดรบกวน ขบวนการสรางกรดแลคติคของแบคทีเรียเจาบาน
5. การตรวจวัดการสรางแลคโตเฟอรินโดย Western blot analysis
วิธีการทดลอง
การเตรียม Cell lysate และ culture supernatant ของแบคทีเรียสําหรับทํา SDS-PAGE
แยกนา้ํ เลี้ยงขามคืนของ L. alctis แตละสายพันธุ จากนั้นนําไปปนเหวยงที่ 6000 rpm 5-10 นาที ที่ 4 oซ แยกเอาเซลลของแบทีเรียและนา้ํ เลี้ยง เก็บใวที่ – 20 oซ เพื่อเตรียมตัวอยางตอไป
การเตรียมสว นของ Cell lysate
นําเซลลทเตรียมไดมาลา งใน TE buffer ปริมาตร 1 มล. จากนั้นนําไปปนเหวยงที่ 6000 rpm 5-10 นาที ที่ 4 oซ นําเซลลที่ปนแยกไดม า suspend ใน TE buffer ปริมาตร 1 มล.จากนั้นเติม trichloroacetic acid (TCA 100%) ปริมาตร 100 ไมโครลิตร ตั้งทิ้งไวบนน้ําแข็ง 20 นาทีเพื่อหยุดขบวนการเมแทบอลิสม ตาง ๆ จากนั้นนําไปปนเหวยงที่ 13,000 g 15 นาที ที่ 4 oซ จากนนลางตะกอนเซลลดวย acetone 80% ปริมาตร 1 มล. จากนั้นนําไปปนเหวี่ยงที่ 13000 g 10 นาที ที่ 4 องศาเซลเซลเซียส ดูดเอาสวนใสทิ้ง จากนนทิ้งไวใหแหงที่อุณหภูมิหอง 5-10 นาที นําเซลลที่ไดมาเติม TE ที่มี lysozyme 5 มก./มล. ปริมาตร 80 ไมโครลิตรจากนั้นเขาอยางแรงเพื่อใหเซลลแตกตั้งทิ้งไวที่ 37 องศาเซลเซียส 30 นาที เติม SDS 20% ปริมาตร 20 ไมโครลิตร นําไปตมที่ 100 องศาเซลเซียส 3 นาที จากนนเติม sampling buffer สําหรับ SDS-
PAGE ปริมาตรเทากัน (100 ไมโครลิตร) นําไปตมอีก 5 นาที vortex ใหเขากัน เก็บไวเพื่อทํา SDS-PAGE
การเตียมสว น Culture supernatant
นําสวน Culture supernatant ปริมาตร 800 ไมโครลิตรมาเติม TCA 100% ปริมาตร 400 ไมโครลิตร ตั้งทิ้งไวบนนา้ํ แข็ง 30 นาที จากนั้นนําไปปนเหวี่ยงที่ 20,000 g 30 นาที ที่ 4 oซ นําตะกอนมา ลางดวย acetone ปริมาตร 250 ไมโครลิตร ละลายตะกอนใน sodium hydroxide (NaOH 50 mM) ปริมาตร 80 ไมโครลิตรจากนนเติม sampling buffer สําหรับ SDS-PAGE ปริมาตรเทากัน (80 ไมโครลิตร) นําไปตม
5 นาที vortex ใหเขากัน เก็บไวเพื่อทํา SDS-PAGE
การทํา SDS-PAGE
ใช 8% Acrylamide gel 200 Volt 60 นาที
การทํา Western blot analysis
Membrane : ใช Nitricellulose membrane Bloting condition : 60 mA 2 ชั่วโมง Bloting condition
Primary antibody: Anti-human lactoferrin antibody (Sigma)
ใช dilution = 1:1000
Secondary antibody: Goat anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate (Sigma)
ใช dilution = 1:30,000 Visualization: NBT/BCIP dye (Promega)
การทดสอบแอนติบอดีสตอแลคโตเฟอรรินมาตรฐาน
เม ทดสอบการตรวจว แลคโตเฟอรรินโดย Wstern blot analysis โดยใชความเขมขนของแลค
โตเฟอรรินมาตรฐานตั้งแต 2500, 1250, 625, 250, 62.5, 16 และ 4 นาโนกรมตามลําดับพบวาสามารถที่จะ ตรวจสอบไดจนถึงระดับ 62.5 นาโนกรัมและไมสามารถตรวจสอบไดตั้งแต 16 นาโนกรมเปนตนไป ดงแสดง ในรูปที่ 7 ซึ่ง ความเขมขนของแลคโตเฟอรรินตั้งแต 125 นาโนกรัม ลงมาไมสามารถยอมเพื่อดูโปรตีนได โดย Coomassie staining ได (ไมไดแสดงรูป)
4 ng 16 ng 62.5 ng 125 ng 250 ng 625 ng 1250 ng 2500 ng
80 kD
รูปที่ 5.1 การทดสอบแอนติบดีสตอแลคโตเฟอรินมาตรฐาน (Sigma) ความเขมขน 4, 16, 62.5, 125,
625, 1250,และ 2500 นาโนกรัม ตามลําดับ
การตรวจสอบการแสดงออกของแลคโตเฟอรรินยีนใน L. lactis แตละสายพันธโดย
Western blot analysis
a) BE31 LF001 b)
BE31 LF001
hLF hLF
1 2 3 1 2 3
รูปที่ 5.2 การตรวจหาการแสดงออกของโปรตีนแลคโตเฟอรินใน L. lactis LF001 โดย Western blot
analysis a) ภายในเซลล และ b) ในน้ําเลยง เลน 1 แลคโตเฟอรินมาตรฐาน 62.5 นาโนกรม ตัวอยางจาก L. lactis BE31 เลน 3 ตัวอยางจาก L. lactis LF001
เลน 2
จากผลการทดลองจะเห็นวาสามารถเห็นแถบของโปรตีนที่จบไดกบแลคโตเฟอรินแอนติบอดีสใน ตําแหนงที่ประมาณ 80 กิโลดาลตัน (รูปที่ 5.2 a) ซึ่งเปนโปรตีนแลคโตเฟอรริน ในการทดลองนี้แลคโตเฟอร รินจะแสดงออกในปริมาณคอนขางตาซึ่งทําใหแบคทีเรียสามารถเจริญเติบโตได เนื่องจากแลคโตเฟอรริน หรือแลคโตเฟอรริซิน มีคุณสมบัติในการยับบั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย สวนในเซลลที่มีการแสดงออก ของแลคโตเฟอรรินในปริมาณมากนั้นอาจจะยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียเซลลและทําใหพลสมิดที่มีอยูไม สามารถสรางโปรตีนที่ตองการได ดังนั้นในการทดลองตอไปจะไดตรวจวดการแสดงออกของยีนในระดับการ transcription โดยการวัด mRNA ดวยวิธี Northern blot hybridization ตอไป
ในการตรวจหาในน้ําเลี้ยงเซลลแบคทีเรียนั้น ไมสามารถตรวจพบโปรตีนแลคโตเฟอรรินโดย แอนติบอดีสไ ด (รูปที่ 5.2b) แสดงใหเห็นวาโปรตีนในนา้ํ เลี้ยงมีปริมาณนอยเกินไปหรือถูกยอยสลายหรือ อาจจะไมมีการปลอยแลคโตเฟอรรินออกมาสูน้ําเลี้ยงเลย ซึ่งจะตองมีการพัฒนาพลาสมิดที่ใชแสดงออก โปรตีนชนิดนี้ตอไป
6. การศึกษาผลของ L. lactis แตละสายพันธุ ตอการเจริญเติบโตของ E.coli JM109
สมมุติฐาน เนื่องจาก Lactoferrin มีฤทธในการยบยั้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียในทางเดินอาหาร
ไดอยางมีประสิทธ าพ ดังนั้นแบคทีเรียที่สามารถสรา ง lactoferrin จะสามารถยับยั้งการ
เจริญเติบโตของแบคทีเรียในหลอดทดลองได
วัตถุประสงค เพื่อทดสอบฤทธิ์ของแบคทีเรียแตละสายพนธตอการยับยงการเจริญเติบโตของแบคทีเรีย
E. coli JM109 ในหลอดทดลอง
วิธีการทดลองไดสรุปดังรูปที่ 6.1 โดยทําการเลี้ยง L. lactis แตละสายพันธ และ E. coli JM109 ขา มคืนที่ 30 oซ และ 37 oซ ตามลําดับจากนนแบง L. lactis แตละสายพันธ และ E. coli JM109 500 ไมโครลิตร เพาะในอาหารเลี้ยงเชอใหม จากนนเลี้ยงตอไปอีก 4 ชวโมงจากนั้นแบง E.coli ที่เจริญจนถึง log phase 1 มล. เติมลงใน L. lactis แตละสายพันธ จากนนเริ่มนับจํานวน E. coli JM109 ที่เจริญรวมกับ L. lactis ในแตละสายพันธ ที่เวลา 0, 2, 4 และ 8 ชวโมงตามลําดับ โดยให E. coli ที่เจริญใน M17 broth เพียง ชนิดเดียวเปนตัวเปรียบเทียบ
L. lactis MG1363
L. lactis BE31
L. lactis LF001 o/n culture E. coli JM109
L. lactis LFN002 o/n culture
L. lactis LFC003
Enoculate to new broth
Culture for 4 hrs (Mid log phase)
Add 1 ml of E. coli to each tube of L. lactis culture
Count number of E. coli in culture medium at 0, 2 , 4 , 8 hours
รูปที่ 6.1 ไดอะแกรมแสดงวิธี Co-culture ของ E.coli และ L. lactis แตละสายพันธ
Growth of E. coli in M17 medium
50
45
40
CFU (x10e6)
35
30
25
20
15
10
5
0
0 2 4 6 8
เวลา (ชั่วโมง)
รูปที่ 6.2 รูปแสดงการเจริญของ E. coli JM109 ในน้ําเลยง M17 ที่ 30 oซ โดยไมมีการเขยา
120.0
100.0
% Viability
80.0
60.0
40.0
20.0
0.0
MG1363 BE31 LF001 LFN002 LFC003
pBE
pLF01 LFN02
pLFC03
0 2 4 6
เวลา (ช โมง)
รูปที่ 6.3 การเจริญเติบโตของ E. coli รวมกับ L. lactis แตละสายพันธุ ในน้ําเลี้ยง M17 ที่ 30 oซ
ผลการทดลอง
E. coli JM109 สามารถเจริญเติบโตไดใน M17 medium ทใชเลี้ยง L. lactis ได ที่ 30 oซ โดยไมมี การเขยา แสดงใหเห็นวานา้ํ เลี้ยงที่มี Erythromycin 1 มก./มล. ไมมีผลตอการเจริญเติบโตของ E. coli JM109 แตเมื่อเลี้ยง E. coli JM109 รวมกับ L. lactis แตละสายพันธุ จะเห็นวา E. coli ไมสามารถ เจริญเติบโตและมีปริมาณลดลงเมื่อเทียบกับตอนเรมตน ซึ่งอาจจะเปนเพราะวาน้ําเลี้ยงของ L. lactis นั้นจะ มีคา pH ลดต่ําลงเมื่อ L. lactis เจริญจนถึง stationary phase ทําให E. coli ไมสามารถเจริญเติบโต และมี จํานวนลดนอยลงเมื่อเวลาในการ co-culture เพิ่มขึ้น ทําใหไมสามารถที่จะเห็นผลของ L .lactis สายพันธุ ที่สรางขึ้นตอการเจริญเติบโตของ E. coli ในหลอดทดลองเนื่องจากความเปนกรดของน้ําเลี้ยง L. lactis ซึ่ง อาจตองเปลี่ยนแปลงสายพันธุของ E. coli หรือหาวิธีที่จะศึกษารูปแบบนี้ตอไป
7. การสราง L.lactis ท รางแลคโตเฟอรรินโดยใช P170 expression system
Background
P170 expression system เปนการสรางโปรตีนโดยใช L.lactis strain MG1363 และ พลาสมิด AMJ2008 ที่ มีโครงสรา งดังรูปที่ 7.1
รูปที่ 7.1 ภาพแสดงโครงสรางพลาสมิด pAMJ2008 [ pAMb1, p15A, ermB, SP31omut2]
โดยที่ระบบการสราง L. lactis MG1363 เปนระบบที่มีการสรางโปรตีนที่สามารถสงออกมาในน้ํา เลยงไดโดย signal peptide ของ SP310mut2 ทําใหส ามารถสราง recombinant lactoferrin ทสี่ ามารถปลอย ออกมาในน้ําเลี้ยงได ซึ่ง plasmid pAMJ2008 และ L. Lactis MG1363 ไดรบจากบริษัท Bioneer ประเทศเดน มารค
วิธีสราง L. lactis สายพันธุ ALFN
ทําการเพิ่มจํานวนยีนของ human lactoferrin บริเวณ N-lobe โดยใช pSKLF ดังการทดลองที่ 1 เปน template และใช primer LFF : 5’-GTGTCCATGGCCGTAGGAGAA GGAGTGTTCA G-3’ กับ LFNR: 5’ – GCA TGG AAT TCT TAC CGG GCC AGA TGG – 3’ โดยไดเพิ่มสวนบริเวณตัดของ เอ็นไซม Sap I และ Sal I เขาไปเพื่อเชื่อมกบั สวน Promoter ใน plasmid AMJ2008 จากนั้นก็ใส พลาส มิดที่สรางขึ้นเขาใน E.coli HB101 เพื่อเพิ่มจํานวนจากนั้นสกัดพลาสมิดดีเอ็นเอจาก E.coli เพื่อนํามา ตรวจดูยีน lactoferrin โดยวิธี PCR พบวาสามาถพบ amplicon ขนาด 730 basepair ซึ่งเปนขนาดของยีน lactoferrin N-lobe ใหชื่อวา pALFN นําพลาสมิดทั้งหมดสงไปหาลําดับของ DNA เพื่อตรวจสอบความ ถูกตองของ Subcloning site ของแตละพลาสมิดโดยใช pSEQ insite reverse primer ที่ 240 bp ซึ่งเมื่อ ตรวจสอบสําดับของดีเอ็นเอบริเวณที่มีการโคลนพบวามีการ subcloning ถูกตองดังตัวอยาง subcloning site รูปที่ 7.2
5’- ATTTACTTCGGAGAGGGTTATTTCAGATAAAAAAAATCCTTAGCTTTCGCTAAGGATGATTTCTGGC AGGGGCGGAGAGACTCGAACTCCCAACACCCGGTTGTCGACCTGCAGGCGGCCGCACTAGTGA TTCTCGATGCTCTTCCGCAGGCCGTAGGAGAAGGAGTGTTCAGTGGTGCGCCGTATCCCAACCC GAGGCCACAAAATGCTTCCAATGGCAAAGGAATATGAGAAAA -240
รูปที่ 7.2 ลําดับของดีเอ็นเอบริเวณ subcloning site โดยใช sequencing primer pSEQ
เมื่อตรวจสอบลําดับและขนาดของชิ้นดีเอ็นเอที่ใสเขาไปในพลาสมิดถูกตองแลวจึงนํา pALFN ไป ขนถายเขาสู Lactococcus lactis โดยวิธี Electroporation ดังอธิบายในขอ 2 จากนั้นไดคดั เลือกสายสาย พันธุ L. lactis (ALFN) เพื่อนํามาศึกษาคุณสมบัติตอไป
8. การศึกษาการแสดงออกของยีนโดยการตรวจหา mRNA ดวยวิธี Northern blot hybridization
วิธีทําการทดลอง
เลี้ยง L. alctis แตละสายพนธุ ในนา้ํ เลยงที่ 30 oซ 16 ชั่วโมง จากนนนําไปปนเหวี่ยงที่ 6000 rpm
15 นาที ที่ 4 oซ แยกเอาเซลลของแบทีเรียออกมาจากนั้นนํามาสก
total RNA ดวย RNA extraction Kit
(Qiagen RNAEasy Mini kit) จากนั้นวัดปริมาณ RNA ที่สกัดไดแลวปรับความเขมขนใหเปน 0.5 μg/μl
การทํา Formaldehyde agarose gel electrophoresis
1. เตรียม 1.2% agarose gel ที่มี 18% formaldehyde
2. เตรียม RNA sample โดยการปรับปริมาตรของ RNA ใหเทากับ 6 ไมโครลิตร จากนั้นนําไปให ความรอนที่ 55 oซ 15 นาที แลวนําไปแชอางน้ําแข็งทันทีเพื่อ denature RNA แลวจึงเติม 2 ไมโครลิตรของ loading buffer
3. หยอดตัวอยางทงหมดลงในหลมแลวทํา electrophoresis โดยใชความตางศักยที่ 50 Volt เปนเวลา
1 ชั่วโมง ใน MOPS buffer
การถายดีเอ็นเอสเมมเบรน
4. นําเจลที่ไดมาลางดวยน้ํากลั่น 4 ครั้ง แลวจึงนํา RNA ที่แยกไดถายลง Nylon Membrane ดวย
Air dry blotting โดยใช 1xSSCE เปน blotting buffer ปลอยทิ้งใวขามคืน
5. นําเมมเบรนที่ไดมาลางดวย SSC buffer จากนั้นนําไปอบใหแหงแลวตรึง RNA บนเมมเบรนโดย การฉายแสงอัลตราไวโอเลต (254 nm) 2 ครั้ง ๆ ละ 10 วินาที
RNA Hybridization
6. เตรียม lactoferrin –N lobe probe ที่ติดฉลากดวย Digoxygenin (DIG) โดยใช DIG high prime and detection kit. และใช primer ในการสราง probe เหมือนกันกับการเตรียมชิ้น DNA LFN
7. นําเมมเบรนที่เตรียมไดมาลางดวย SSC buffer 5 ครั้ง เติม pre-hybridization buffer แลว
incubate ดวย Hybridization buffer ที่มี DNA probe จากนั้น incubate ขามคืน
8. เมอื่ ครบเวลาลางเมมเบรน 2 ครั้ง ๆ ละ 5 นาทีดวย washing buffer จากนั้นลา งอีกครั้งดวย SSC
9. แชใน Blocking buffer 10 นาที แชตอใน Antibody solution อีก 30 นาที ลางเมมเบรนแลว แชใน
Detection buffer 10 นาที
10. หยดสับสเตรท CSPD 5-10 หยด แลวหอดวยพลาสติก นําไปประกบฟลม X-ray
ผลการทดลอง
เมอตรวจสอบการแสดงออกของยีนแลคโตเฟอรรินในระดับ transcription โดยวิธี Northern blot hybridization ดวย DNA probe ที่จําเพาะตอ mRNA ของแลคโตเฟอรริน พบวาสามารถตรวจวดั ระดับ mRNA ของยีนแลคโตเฟอรรินที่แสดงออกใน L.lactis สายพนธ LF001 และ ALFN แสดงในรูปที่ 8.1 แตไมสามารถตรวพบไดในสายพนธที่ใสพลาสมิดนําพาอยางเดียว (BE31) และสายพันธที่ใสยีนแลคโตเฟอร รินทเชอมตอกับ CcpA Promoter (LFN002 และ LFC003; ไมไดแ สดงในภาพ) อาจเปนเนื่องจาก Promoter นี้นาจะตองมีการควบคุมอยางอื่นรวมดวยหรอื mRNA ที่ไดจากการแสดงออกนไมเสถียรซึ่งจะตองมี การศึกษาตอไป จากผลการทดลองแสดงใหเห็นวา L. lactis สายพันธ LF001 และ ALFN สามารถแสดงออก ยีนแลคโตเฟอรรินในระดับ mRNA ซึ่งสามาถตรวจสอบไดโดยวิธี Northern blot hybridization จึงคัดเลือด เอาสองสายพันธนี่ไปศึกษาผลในการตานการเกิดรอยโรคมะเร็งลําใสใหญ aberrant crypt foci ในหนูขาวที่ ไดรับสารกอมะเร็งไดเมธิลไฮดราซีน
1 2 3
18s rRNA
รูปที่ 8.1 Northern blot hybridization โดยใช Lactoferrin cDNA probe เปนตัวติดตาม เลน 1 RNA สกัด จาก L. lactis (pBE31), เลน 2 RNA สกัดจาก L. lactis (LF001), เลน 3 RNA สกัดจาก L. lactis (ALFN),
9. การศึกษาผลของ Lactococcus lactis ทใสยีนแลคโตเฟอรรินตอการเกิดรอยโรคเริ่มตนของการเกิด มะเร็งลําไสใหญในระยะเริ่มตน
วัตถุประสงค เพื่อที่จะศึกษาถึงผลของ L. lactis ที่มียีนที่ผลิตแลคโตเฟอรรินตอการเกิดรอยโรคเริ่มตนของการ เกิดมะเร็งลําไสใหญ (Aberrant crypt foci; ACF) ในระยะเริ่มตน
วิธีการทดลอง
ในการศึกษานี้จะใชใชหนู Wistar อายุ 4 สัปดาห (80 – 90 กรัม) โดยจะแบงหนูเปนกลุมดังนี้ กลุม 1 Saline + Saline
กลุม 2 L. Lactis MG1363
กลุม 3 L. Lactis MG1363 BE31 + saline
กลุม 4 L. Lactis MG1363 LF01 + saline
กลุม 5 L. Lactis MG1363 (pAMJ2008) + saline
กลุม 6 L. Lactis MG1363 (pALFN) + saline
กลุม 7 Saline + DMH 40 mg/kg wt
กลุม 8 L. Lactis MG1363 + DMH 40 mg/kg wt
กลุม 9 L. Lactis MG1363 BE31 + DMH 40 mg/kg wt
กลุม 10 L. Lactis MG1363 LF01 + DMH 40 mg/kg wt
กลุม 11 L. Lactis MG1363 (pAMJ2008) + DMH 40 mg/kg wt
กลุม 12 L. Lactis MG1363 (pALFN) + DMH 40 mg/kg wt
โดยหนูแตละกลุมจะไดรบั การปอน L.lactis ในแตละสายพันธที่แขวนลอยใน saline หรือ ปอน saline สําหรับกลุมควบคุม โดยการเตรียม L. lactis แตละสายพัธุจะเตรียมใหไดปริมาณเซลล 1011 เซลล/ 100 ไมโครลิตร ดังนี้
5 strains of L. lactis
200 μl enoculate to 12 ml M17G5 media 30 oC 14 hrs
O/N culture Cell pellet
3500 rpm 15 min 4 oC
Suspend in 1.2 ml saline (for 10 rats)
i.g 100 ul of suspension
(10 11 CFU/rat/day for 5 times a weak)
สปดาห
0 1 2 3 4 5
Saline ฆาและเก็บใส
Group 1 - 6
DMH 40 mg/Kg wt (sc.)
Group 7 - 12
เก็บอุจาระเพ
นบจํานวนแบคทีเรียในลําใส (ทุก ๆ วันเสาร
= Sacrifice
รูปที่ 9.1 Protocol สําหรับการศึกษาในระยะเริ่มตน
ในระยะเริ่มตนหนูจะไดรับการปอนเซลลแบคทีเรียกอน 1 สปั ดาห และตอเนื่องไปตลอดการทดลอง และจะฉีด Dimethyl hydrazine (DMH) 40 mg/Kg wt ใตผิวหนงั บริเวณใหลขวาปริมาตร 0.1 มล.ตอ 100
กร น้ําหนกตวั สัปดาหละครัง จํานวน 2 คร (DMH จะเตรียม 40 มก./มล. ในสารละลาย 0.4 N Sodium
Hydroxide เพื่อปรับ pH ใหไดประมาณ 7.3) ตาม protocol เม ครบ 5 สปั ดาหหนูทุกตัวจะถูกฆาโดย
diethyl ether จากนั้นผาแยกลําใสใ หญ และ ฉีด 10% Formalin เขาไปในลําไสเพื่อขยายแลววางบนนาแข็ง
อยางน
ย 15 นาที จากนนตดแยกเปนช
ๆ แลวตรึงใว
นกระดาษกรอง แชใน 10% Formalin แลวจึงยอม
ดวย 2%methylele blue นับและบันทึกจํานวน ACF และ ขนาด
ในแตละส ดาหจะนําอุจาระของหนูในแตละกลุมมาหาปริมาณแอโรบิคแบคทีเรีย โดยนําอุจจาระหน
ที่เก็บไดจากทวารหนกหนู มา เจือจางใน saline อัตราสวน 1:10 จากนั้นเจือจางตอเนื่องจนได 1: 106 นําไป เพาะเลยง LB agar plate บมใวที 37 oซ ขามคืน จากนั้นนํามานับจํานวนแบคมเรยที่เจริญบนแตละเพลทหา คาเฉลี่ยจากหนูสามตัวตอกลุมแลวคํานวณเปน CFU/กรัมของอุจาระ
สวนในระยะสงเสริม แผนการทดลองแสดงในรูปที่ 9.2 หนูจะไดรับการฉีด Dimethylhydrazine (DMH) 40 มก./กก. น้ําหนักตัว สปั ดาหละ ครั้ง จํานวน 2 ครั้งเชนเดียวกับในระยะเริ่มตน จากนั้นสัปดาหที่ 5 จึงเริ่มปอนเซลลแบคทีเรีย และตอเนื่องไปตลอดการทดลอง ตาม แผนการทดลอง เมื่อครบ 36 สัปดาหหนูทุก ตัวจะถูกฆาโดย diethyl ether จากนั้นผาแยกลําใสใหญ และ ฉีด 10% Formalin เขาไปในลําไสเพื่อขยายแลว วางบนน้ําแข็งอยางนอย 15 นาที จากนั้นตัดแยกเปนชนิ้ ๆ แลวตรึงใวบนกระดาษกรอง แชใน 10% Formalin แลว จึงยอมดวย 2%methylele blue นับจํานวน ACF ภายใตกลองจุลทัศน นับและบันทึกจํานวน และขนาด ของ ACF ในลําใสของหนู
สปดาห
0 1 2 3 4 5 10 15 20 25 30 36
Saline
ฆาและเก็บใส
Group 1 - 6
DMH 40 mg/Kg wt (sc.)
Group 7 - 12
รูปที่ 9.2 แผนการทดลองสําหรับการศึกษาในระยะสงเสริม
ผลการทดลอง
ในการศึกษาระยะเริ่มตนพบวาหนูทุกกลมมีน้ําหนักตัวที่ไมแตกตางกันตลอดการทดลอง แสดงใน รูปที่ 9.3 แสดงใหเห็นวาการไดรับแบคทีเรียในแตละสายพันธุไมมีผลตอการเจริญเติบโตของสัตวทดลอง เมื่อตรวจสอบการเกิด Aberrant crypt foci ในลําใสของหนูทดลอง ไมพบ การเกิด aberrant crypt foci ใน หนูกลุมทไี่ ดรับการฉีด saline เมื่อเปรียบเทียบในกลมุ ที่ไดรับ DMH หนูทไี่ ดรับการปอน L. lactis ทุกสาย พนธจะพบจํานวน ACF มากกวาหนูที่ไดรับการปอน saline (249.0+79.1 ACF/rat) สวนหนูทไี่ ดรับ L.lactis ที่มียีนแลคโตเฟอรริน (L. lactis LF001); 222.7+14.7 ACF/rat) จะมีจํานวน ACF ลดลง 19.5% เมื่อเทียบกับ L.lacts ที่ใสเฉพาะ พลาสมิด (BE31; 277.0+45.9) และ โดยเฉพาะหนูทไี่ ด L. lactis สายพันธุ ALFN สามารถลดจํานวน ACF (155.2+22.8 ACF/rat) และ ACF ที่มีมากววา 3 Ac/f (16.7+18.8 ACF/rat) ไดอยางมีนัยสําคัญ เมื่อเทียบกับหนูที่ไดรับการปอน L. lactis AMJ2008 (290.8+59.7 ACF/rat; p<0.05) (46.6% และ 68.0% ตามลําดับ) แสดงในตารางที่ 9.1 และรูปที่ 9.4 เมื่อนําแอโรบิคแบคทีเรียในอุจาระ ของหนูที่ไดรับแบคทีเรียสายพันธุตาง ๆ พบวาแตละกลมมีจํานวนแบคทีเรียในลําไสที่ไมแตกตางกันในชวง
1.6 x109 - 4.8x 109 CFU/กรมอุจาระ ตลอด 5 สัปดาห ดังแสดงในรูปที่ 9.5 แสดงใหเห็นวาการไดรับ L. lactis แตละสายพันธุไมมีผลตอการเจริญของแบคทีเรียในลําไสของหนูแตละกลุม ดังนั้นการยับยั้งการเกิด ACF โดย L.lactis ที่แสดงออกยีนแลคโตเฟอรรินนั้นไมเกยวของกับการเปลี่ยนแปลงจํานวนของแบคทีเรีย เจาบานในลําไสของหนูขาวและพบวาวา การไดรับแบคทีเรีย L. lactis รวมกับ DMH จะกระตุนใหมีการเกิด ACFมากขึ้นกวาที่ไดรับ DMH เพียงอยางเดียว แตเมื่อเปรียบเทียบกับ L. lactis ที่มีการแสดงออกของแลค โตเฟอรรินทั้งสองสายพันธจะเห็นวาทั้งสองสายพนธุมีความสามารถที่จะยับยั้งกระบวนการเกิด Aberrant crypt foci ในลําไสของหนูขาวที่ไดรับ DMH เมื่อเปรียบเทียบกับ L. lactis ที่มี empty plasmid ดังนั้นจึงตอง มีการศึกษาถึงกลไกในการกระตุนการเกิด ACF โดย L. lactis แบะการยับยั้งโดยแลคโตเฟอรรินที่สรางจาก
L. lactis ตอไป
300.0
250.0
200.0
150.0
100.0
50.0
0.0
Wk0
Wk1
Wk2
Wk3
Wk4
Wk5
Water MG1363 BE31 LF01 2008 LFN
Saline + DMH MG1363 + DMH BE31 + DMH LF001 + DMH AMJ2008 + DMH LFN + DMH
น้ําหนักหนูรายสัปดาห (กรัม)
รูปที่ 9.3 แสดงนาหนกหนูเฉลี่ยเปนรายส ดาหในทุก ๆ กลุม
กลุม | Treatment | จํานวน | Aberant | crpt foci | AC/F | |
Total | AC>3 | |||||
1 | Saline | 4 | 0 + 0.0 | 0 + 0.0 | - | |
2 | L.lactis MG1363 | 4 | 0 + 0.0 | 0 + 0.0 | - | |
3 | L.lactis BE31 | 4 | 0 + 0.0 | 0 + 0.0 | - | |
4 | L.lactis LF001 | 4 | 0 + 0.0 | 0 + 0.0 | - | |
5 | L.lactis 2008 | 4 | 0 + 0.0 | 0 + 0.0 | - | |
6 | L.lactis ALFN | 4 | 0 + 0.0 | 0 + 0.0 | - | |
7 | Saline + DMH | 6 | 249.0 + 79.1 | 29.8 + 33.3 | 1.98 + 0.21 | |
8 | L.lactis MG1363 + DMH | 6 | 281.7 + 65.2 | 42.8 + 21.6 | 2.21 + 0.17 | |
9 | L.lactis BE31+ DMH | 6 | 277.0 + 45.9 | 36.5 + 24.7 | 2.07 + 0.20 | |
10 | L.lactis LF001+DMH | 6 | 222.7 + 14.7 | 25.8 + 15.1 | 2.09 + 0.19 | |
11 | L.lactis 2008 +DMH | 6 | 290.8 + 59.7 | 52.2 + 27.5 | 1.96 + 0.21 | |
12 | L.lactis ALFN+DMH | 6 | 155.2 + 22.8 * | 16.7 + 18.8* | 2.02 + 0.38 |
ตารางที่ 9.1 ตารางแสดงจํานวน aberrant crypt foci (ACF) ขนาด (เฉลี่ย aberrant crypt/focus ; Ac/f) และ ACF ที่มีขนาดใหญกวา 3 Ac/focus ในลําใสข องหนูขาวที่ไดรับ dimethyl hydrazine (DMH) และ L. lactis สายพนธต าง ๆ ในระยะเริ่มตน (แสดงเปนคาเฉลี่ย+SD)
* significant (p<0.05) เทียบกับกลุม L.lactis 2008 +DMH
H20
450.0
400.0
350.0
300.0
250.0
200.0
150.0
100.0
50.0
0.0
*
*
Total
AC>3 crypt/focus
Saline MG1363 BE31 LF01 AMJ2008 LFN
No of ACF/rat
รูปที่ 9.4 แสดงจํานวน aberrant crypt foci (ACF) และ ACF ที่มีขนาดใหญกวา 3 Ac/focus ในลําใสของ
หนูขาวทไี่ ดรับ dimethyl hydrazine (DMH) และ L. lactis สายพันธ
าง ๆ ในระยะเริ่มต
* p<0.05
12
10
8
6
4
2
0
week1
week2
week3
week4
week5
Saline MG1363 BE31
LF001
AMJ2008 ALFN
Log10 CFU/gram fecies
รูปที่ 9.5 จํานวนแบคทีเรียในอุจาระของหนูขาวที่ไดรับ DMH และแบคทีเรียสายพันธุตาง ๆ คาที่ไดแสดงเปน log CFU/ กรัม เฉลี่ยจากสามตัวตอ 1 กลุม
สวนการทดสอบในระยะสงเสริมมีแนวโนม ที่จะใหผลเชนเดียกันกบระยะเรมตน ดงแสดงในตาราง ที่ 9.2 และรูปที่ 9.6 โดยที่หนูทไี่ ดรับ L.lactis ที่มียีนแลคโตเฟอรริน (L. lactis LF001) จะมีจํานวน ACF และ ACF ที่มีมากววา 3 Ac/f เทากับ 255.8+86.7 และ 135.2+35.6 ซึ่งมีจํานวนลดลงเล็กนอยมื่อเทียบกับ L.lacts ทใี่ สเฉพาะ พลาสมิด (BE31) (ACF= 352.7+78.1 ACF>3 = 196.2+29.8) สามารถคิดเปนรอยละ ไดเ ทากับ 27.0 % เและ 32.4% ตามลําดับ แตในดานหนูที่ได L. lactis สายพันธุ ALFN สามารถลดจํานวน ACF ไดเพียง 13.7% เมื่อเทียบกับหนูทไี่ ดรับการปอน L. lactis AMJ2008 และไมพบความแตกตางของ จํานวนACF ที่มีมากกวา 3 AC/f ระหวางสองกลุมนี้ แสดงใหเห็นวา L. lactis ทสี่ รางแลคโตเฟอรินจะไม แสดงผลชัดเจนในระยะสงเสริม ซึ่งกลไกที่ชัดเจนยังตองมีการศึกษาตอไป
ตารางที่ 9.2 ตารางแสดงจํานวน aberrant crypt foci (ACF) ขนาด (เฉลี่ย aberrant crypt/focus ; Ac/f)
และ ACF ที่มีขนาดใหญกวา 3 Ac/focus ในลําใสข องหนูขาวทไี่ ดรับ dimethyl hydrazine (DMH) และ
L. lactis สายพันธต าง ๆ ใน Promotion stage (แสดงเปนคาเฉลี่ย+SD)
กลุม Treatment จํานวน Aberant crpt foci AC/F
Total | AC>3 | |||
1 Saline | 4 | 0 + 0.0 | 0 + 0.0 | - |
2 L.lactis MG1363 | 4 | 0 + 0.0 | 0 + 0.0 | - |
3 L.lactis BE31 | 4 | 0 + 0.0 | 0 + 0.0 | - |
4 L.lactis LF001 | 4 | 0 + 0.0 | 0 + 0.0 | - |
5 L.lactis 2008 | 4 | 0 + 0.0 | 0 + 0.0 | - |
6 L.lactis ALFN | 4 | 0 + 0.0 | 0 + 0.0 | - |
7 Saline + DMH | 6 | 186.8 + 59.7 | 90.5 + 21.3 | 4.17 + 1.02 |
8 L.lactis MG1363 + DMH | 6 | 263.3 + 53.8 | 131.8 + 50.4 | 4.52 + 1.34 |
9 L.lactis BE31+ DMH | 6 | 352.7 + 78.1 | 196.2 + 29.8 | 4.79 + 1.13 |
10 L.lactis LF001+DMH | 6 | 255.8 + 86.7 | 135.2 + 35.6 | 4.29 + 0.83 |
11 L.lactis 2008 +DMH | 6 | 253.0 + 54.1 | 132.7 + 41.1 | 4.51 + 1.31 |
12 L.lactis ALFN+DMH | 6 | 218.1 + 79.8 | 135.5 + 31.9 | 4.94 + 1.25 |
H20
500.0
450.0
400.0
350.0
300.0
250.0
200.0
150.0
100.0
50.0
0.0
Total
AC>3 crypt/focus
Saline MG1363 BE31 LF01 AMJ2008 LFN
No of ACF/rat
รูปที่ 9.6 แสดงจํานวน aberrant crypt foci (ACF) ขนาด (เฉลี่ย aberrant crypt/focus ; Ac/f) และ ACF ที่มีขนาด
ใหญกวา 3 Ac/focus ในลําใส
องหนูขาวทไี่ ดรับ dimethyl hydrazine (DMH) และ L. lactis สายพนธตาง ๆ ใน
Promotion stage
สรุปผลงานวิจัย
การทดลองนี้มีวัตถุประสงคเพื่อที่จะเพ
สรางแบคทีเรียในลําไสในกลุมของ Lactococcus lactis ใหสามารถ
ผลิตแลคโตเฟอรินโดยใชเทคนิคทางพนธุวิศวกรรม และทดสอบฤทธิ์ของ recombinant bacteria ที่สรา งขึ้นตอการเกิด มะเร็งลําไสในหนูขาวที่ไดรับไดเมธิลไฮดราซีน
จากการทดลองสรุปวาผูวิจัยสามารถสรา ง L. lactis ที่สามารถแสดงออกของยีนแลคโตเฟอรริน แตการ ตรวจสอบในระดบโปรตีนสามารถทําไดอยางจํากัดเนองจากเปนการสรางโปรตีนของมนุษยในแบคทีเรียเซลลซึ่งอาจ ทําใหโครงสรา งของโปรตีนเปลี่ยนแปลงไปไมสามารถจับไดกับแอนติบอดีส หรือเนองจากแลคโตเฟอรรินและสวนยอย ของแลคโตเฟอรรินมีฤทธิ์ยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียทําใหการแสดงออกตองถูกจํากัด อยางไรก็ตามผูวิจัยสามารถ ตรวจสอบการแสดงออกในระดับ mRNA ภายในเซลลของแบคทีเรียในสายพันธุที่นําไปทดสอบฤทธิ์ตานการเกิด aberrant crypt foci ในลําไสของหนูขาวที่ไดรับสารกอมะเร็ง Dimethylhydrazine (DMH)
เมื่อทดสอบฤทธิ์ตานการเกิด aberrant crypt foci ในลําไสของหนูขาวที่ไดรับสารกอมะเร็ง DMH ในระยะ เริ่มตนพบวาหนูที่ไดรับ DMH รวมกับ L. lactis ทุกสายพันธุเหนี่ยวนําใหเกิด ACF เพิ่มมากขึ้นเมื่อเทียบกับหนูที่ ไดรับ DMH เพียงอยางเดียว อยางไรก็ตาม หนูที่ไดรับ L. lactis ที่แสดงออกยีนแลคโตเฟอรริน (LF01 และ LFN) ก็ สามารถที่จะลดอุบัติการของการเกิด ACF ไดเมื่อเทียบกับหนูที่ไดรับ L. lactis ที่มีพลาสมิดนําพาเทานั้น (BE31 และ AMJ2008) และก็มีแนวโนมที่จะมีผลในระยะสงเสริม แตไมมีความแตกตางทางสถิติ
จากการทดลองจึงเปนแนวทางเริ่มตนที่จะพัฒนาการผลิตแบคทีเรียในลําใสทสามารถผลิตสารที่มีประโยชน โดยใชเทคนิคทางพันธุวิศวกรรมที่ปลอดภัย ภายในลําใสใหญเพื่อปองกันการเกิดความผิดปกติและการพัฒนาไปเปน มะเร็งลําไสตอไป
การเสนอผลงาน
นําเสนอผลงานในรูปแบบของโปสเตอร
1. Construction of lactoferrin-producing Lactococcus lactis and properties of its recombinant protein การประชุมนักวิจัยรนใหมพบเมธีวิจยอาวุโส สกว. วันที่ 14-16 มกราคม 2548 โรงแรมเฟลิกซ ริเวอรแคว จังหวัดกาญจนบุรี
2. Construction of lactoferrin-producing Lactococcus lactis and properties of its recombinant protein การประชุม The third Takeo Wada Cancer Research Symposium วันที่ 24-25 กุมภาพันธ 2548 มหาวิทยาลัยขอนแกน จ. ขอนแกน
3. Modulation of dimethylhydrazine (DMH)-induced aberrant crypt foci formation by lactoferrin- producing Lactococcus lactis การประชุม APCOCP Satellite meeting; Modeling for detection of environmental carcinogens and modifying agents in the Asian Pacific. วันที่ 6-7 พฤศจิกายน 2549 ณ โรงแรมเชียงใหมออรคิด จ. เชียงใหม
ภาคผนวก
34
35
36