İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ SAĞ. BİL. ENST.

A.XXXXX XXXXXXX

Adınızı soyadınızı giriniz

İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ SAĞ. BİL. ENST.

Tez kabul edildikten sonra yapılan sabit ciltte sırt yazısı bu şablona göre yazılacak. Yazılar tek satır olacak Cilt sırtı yazıların yönü yukarıdan aşağıya

(sol yandaki gibi) olacak .

DOKTORA TEZİ

Tez, Yüksek Lisans’sa, YÜKSEK LİSANS TEZİ; Doktora ise DOKTORA TEZİ ifadesi kalacak

İSTANBUL-2006

Tez Sınavının yapılacağı yılı yazınız

T.C.

İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

DOKTORA TEZİ

DENEYSEL OLARAK OLUŞTURULAN KEMİK DEFEKTLERİNDE İKİ FARKLI KRİYOJEN MADDE OLAN SIVI NİTROJEN VE KARBONDİOKSİT GAZI UYGULAMASININ KEMİK İYİLEŞMESİ ÜZERİNE OLAN ETKİLERİNİN HİSTOPATOLOJİK OLARAK DEĞERLENDİRİLMESİ

A.XXXXX XXXXXXX

DANIŞMAN

PROF.DR. XXXXXX XXXXXX XXXX

DİŞHEKİMLİĞİ FAKÜLTESİ

AĞIZ DİŞ ÇENE HASTALIKLARI VE CERRAHİSİ ANABİLİM DALI

İSTANBUL-2006

TEZ ONAYI

Aşağıda tanıtımı yapılan tez, jüri tarafından başarılı bulunarak Yüksek lisans / Doktora. Tezi olarak kabul edilmiştir.

/ /

Prof.Dr.Xxxxx Xxxxxxx Enstitü Müdürü

Kurum : İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Program Adı :

Programın seviyesi : Yüksek Lisans ( ) Doktora ( X ) Anabilim Dalı : Ağız Diş Çene Hastalıkları ve Cerrahisi A.D.

Tez Sahibi : A. Xxxxx XXXXXXX

Tez Başlığı : Deneysel olarak oluşturulan kemik defektlerinde sıvı nitrojen ve karbondioksit gazı uygulamasının kemik iyileşmesi üzerine olan etkilerinin histopatolojik olarak değerlendirilmesi

Sınav Yeri : Altan Xxxxxx Xxxxxxx Konferans Salonu Sınav Tarihi : 22.11.2006 / 10:00

Tez Sınav Jürisi

0.Xxxx. Dr. Xxxxxx Xxxxxx XXXX(Tez Danışmanı), İstanbul Üniv.,Diş Hekimliği Fak., Ağız Diş Çene Hastalıkları ve Cerrahisi ABD.

2. Prof. Dr. Xxxxx XXXXXXXXX(Tez İzleme Komitesi), İstanbul Üniv., Diş Hekimliği Fak., Ağız Diş Çene Hastalıkları ve Cerrahisi ABD.

3. Prof. Dr. Xxxxx XXXXX(Tez İzleme Komitesi), İstanbul Üniv., Diş Hekimliği Fak., Ağız Diş Çene Hastalıkları ve Cerrahisi ABD.

4. Prof. Dr. Xxxxxxxxx XXXXXX , İstanbul Üniv., Diş Hekimliği Fak., Ağız Diş Çene Hastalıkları ve Cerrahisi ABD.

0.Xxxx. Dr. Xxxxx XXXXX, Marmara Üniv. Diş Hekimliği Fak., Ağız Diş Çene Hastalıkları ve Cerrahisi ABD.

BEYAN

Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlanmasından yazımına kadar bütün safhalarda etik dışı davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün bilgileri akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tez çalışmayla elde edilmeyen bütün bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları da kaynaklar listesine aldığımı, yine bu tezin çalışılması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal edici bir davranışımın olmadığı beyan ederim.

X.Xxxxx XXXXXXX

aileme…

TEŞEKKÜR

Doktora eğitimim süresince bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım, bana her zaman destek olan danışmanım ve sayın hocam Prof. Dr. Xxxxxx Xxxxxx XXXX’a ;

Desteklerinden ötürü İ.Ü. Xxxx, Diş, Çene Hastalıkları ve Cerrahisi A. D. Başkanı Prof. Dr. Xxxxxxxxx XXXXXX, İ. Ü. Xxxx, Diş, Çene Hastalıkları ve Cerrahisi öğretim üyesi Prof.Dr. Xxxxx XXXXXXXXX’xx ve sayın hocalarıma;

Tüm çalışmam boyunca hiçbir yardımı esirgemeyen Prof. Dr. Xxxxxx XXXXX’a

İstanbul Üniversitesi. Onkoloji Enstitüsü Tümör Patolojisi ve Onkolojik Sitoloji Anabilim Dalı’nda doktora bulgularının histopatolojik değerlendirmelerini titizlikle gerçekleştiren Dr. Xxxxx XXXXXXXXX ve Dr. Xxxxx XXXXX’x ;

Doktora çalışmamın istatistiksel değerlendirmesini yapan Dr. Xxxx XXXXXXXXXXX’xx;

Gösterdikleri dostluk, yardım ve anlayıştan dolayı Dr. Xxxxx XXXX, Dr. R. Xxx XXXXXX, Dt. Xxxxxx Xxx XXXXX, Dt. Xxxxx XXXXX ve sevgili çalışma arkadaşlarıma;

Xxxxx XXXXXXXX ve Xxxxxx XXXXXXXX’a,

Hayatım boyunca hep yanımda olan ve beni destekleyen ailem; Xxxxxxxxx XXXXXXX,

İnci ÇANKAYA ve Xxxxxxx XXXXXXX’ya;

teşekkür ederim.

İÇİNDEKİLER

TEZ ONAYI İİ

BEYAN İİİ

TEŞEKKÜR V

İÇİNDEKİLER Vİ

TABLOLAR LİSTESİ İX

ŞEKİLLER LİSTESİ Xİ

SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ Xİİİ

ÖZET XİV

ABSTRACT XV

1. GİRİŞ VE AMAÇ 1

2. GENEL BİLGİLER 4

2.1. Kemik Dokusu 4

2.1.1 Kemik dokusunun mikroyapısal bileşenleri 5

2.1.1.1. Osteoprogenitör Hücreler 5

2.1.1.2. Osteoblastlar 6

2.1.1.3. Osteositler 8

2.1.1.4. Osteoklastlar 9

2.1.1.5. Kemik yüzeyini döşeyen hücreler 10

2.1.1.6. Matriksler 10

2.1.1.6.1 Organik matriks 11

2.1.1.6.2 İnorganik matriks 12

2.1.1.7. Çözünebilen faktörler 12

2.1.1.8. Periost 14

2.1.1.9. Endost 15

2.1.1.Kemik dokusunun makroyapısal bileşenleri 15

2.1.2.1. Primer Kemik Dokusu(Woven Kemik) 15

2.1.2.2. Sekonder Kemik Dokusu 16

2.1.2.2.1 Kortikal kemik 16

2.1.2.2.2 Kansellöz kemik 17

2.1.3. Kemik dokusu embriyogenezi 18

2.1.3.1 İntramembranöz gelişim 18

2.1.3.2. Endokondral gelişim 20

2.1.4. Kemik dokusu iyileşmesi 21

2.1.4.1. Enflamasyon fazı 22

2.1.4.2. Onarım (reperasyon) fazı 23

2.1.4.3 Yeniden şekillenme(remodeling) 26

2.1.5. Kemik İyileşmesini Etkileyen Faktörler 27

2.1.5.1. Lokal Faktörler 27

2.1.5.2. Genel Faktörler 30

2.2. Kriyoterapi 33

2.2.1. Kriyojen maddeler 34

2.2.2. Kriyoterapide kullanılan aletler 36

2.2.3. Kriyoterapide monitorizasyon 39

2.2.4. Kriyobiyoloji 41

2.2.5. Kriyoterapinin avantajları 44

2.2.6. Kriyoterapi kontraendikasyonları 44

2.2.7. Kriyoterapinin komplikasyonları 45

3. GEREÇ VE YÖNTEM 46

3.1. Gereç 46

3.2. Yöntem 46

3.2.1. Deney hayvanları ve grupları 46

3.2.2. Cerrahi uygulamalar 49

3.2.3. Kriyoterapi uygulamaları 52

3.2.4.Işık mikoskopu takibi ve değerlendirme kriterleri 53

3.2.5. İstatistiksel değerlendirme yöntemleri 55

4. BULGULAR 56

4.1. Işık mikroskobu değerlendirmeleri 56

4.1.1 Kontrol grupları 56

4.1.1.1. 3 günlük kontrol grubu 56

4.1.1.2. 7 günlük kontrol grubu 56

4.1.1.3. 14 günlük kontrol grubu 57

4.1.1.4. 21 günlük kontrol grubu 57

4.1.1.5. 28 günlük kontrol grubu 58

4.1.1.6. 45 günlük kontrol grubu 58

4.1.1.7. 60 günlük kontrol grubu 59

4.1.2 Karbokdioksit gazı grubu 59

4.1.2.1. 3 günlük karbokdioksit gazı grubu 59

4.1.2.2. 7 günlük karbokdioksit gazı grubu 59

4.1.2.3.1.1.1. 14 günlük karbokdioksit gazı grubu 60

4.1.2.4. 21 günlük karbokdioksit gazı grubu 60

4.1.2.5. 28 günlük karbokdioksit gazı grubu 61

4.1.2.6. 45 günlük karbokdioksit gazı grubu 62

4.1.2.7. 60 günlük karbokdioksit gazı grubu 62

4.1.3 Sıvı nitrojen grubu 63

4.1.3.1 3 günlük sıvı nitrojen grubu 63

4.1.3.2. 7 günlük sıvı nitrojen grubu 63

4.1.3.3 14 günlük sıvı nitrojen grubu 64

4.1.3.4. 21 günlük sıvı nitrojen grubu 65

4.1.3.5. 28 günlük sıvı nitrojen grubu 65

4.1.3.6. 45 günlük sıvı nitrojen grubu 66

4.1.3.7. 60 günlük sıvı nitrojen grubu 67

4.2 İstatistiksel bulgular 68

4.3 İstatistiksel bulguların değerlendirilmesi 82

5. TARTIŞMA 93

KAYNAKLAR 112

HAM VERİLER 130

ETİK KURUL KARARI 137

ÖZGEÇMİŞ 138

TABLOLAR LİSTESİ

Tablo 2.1: Kriyojen maddelerin kaynama dereceleri 35

Tablo 3.1: Katı yem içeriği 47

Tablo 4.1: Yeni kemik yapımının gruplara ve günlere göre istatistiksel karşılaştırılması 68

Tablo 4.2: Yeni kemik yapımının gruplar içinde karşılaştırılması 69

Tablo 4.3: Yeni kemik yapımının gruplar içinde günlere göre karşılaştırılması 69

Tablo 4.4: Yemi kemik yapımının gruplara ve günlere gore dağılımının grafik

olarak karşılaştırılmaları 70

Tablo 4.5: Fibrozisin gruplara ve günlere göre istatistiksel karşılaştırılması 71

Tablo 4.6: Fibrozisin gruplar içinde karşılaştırılması 72

Tablo 4.7: Fibrozisin gruplar içinde günlere gore karşılaştırılması 72

Tablo 4.8: Fibrozisin gruplara ve günlere gore dağılımının grafik

olarak karşılaştırılmaları 73

Tablo 4.9: Nekrozun gruplara ve günlere göre istatistiksel karşılaştırılması 74

Tablo 4.10: Nekrozun gruplar içinde karşılaştırılması 75

Tablo 4.11: Nekrozun gruplar içinde günlere gore karşılaştırılması 75

Tablo 4.12: Nekrozun gruplara ve günlere gore dağılımının grafik

olarak karşılaştırılmaları 76

Tablo 4.13: İltihabın gruplara ve günlere göre istatistiksel karşılaştırılması 77

Tablo 4.14: İltihabın gruplar içinde karşılaştırılması 78

Tablo 4.15: İltihabın gruplar içinde günlere gore karşılaştırılması 78

Tablo 4.16: İltihabın gruplara ve günlere gore dağılımının grafik

olarak karşılaştırılmaları 79

Tablo 4.17: Gruplara göre kırık dağılımının istatistiksel değerlendirilmesi 80

Tablo 4.18: Gruplara göre primer yara kapanmasının gruplara göre dağılımının

İstatistiksel değerlendirilmesi 81

Tablo 7.1: 3. güne ait deney grupları ve kontrol gruplarının değerlendirme sonuçları.130 Tablo 7.2: 7. güne ait deney grupları ve kontrol gruplarının değerlendirme sonuçları.131

Tablo 7.3: 14. güne ait deney grupları ve kontrol gruplarının değerlendirme sonuçları 132

Tablo 7.4: 21. güne ait deney grupları ve kontrol gruplarının değerlendirme sonuçları 133

Tablo 7.5: 28. güne ait deney grupları ve kontrol gruplarının değerlendirme sonuçları 134

Tablo 7.6: 45. güne ait deney grupları ve kontrol gruplarının değerlendirme sonuçları 135

Tablo 7.7: 60. güne ait deney grupları ve kontrol gruplarının değerlendirme sonuçları 136

ŞEKİLLER LİSTESİ

Şekil 2.1: Kemik hücrelerinin kökeni 6

Şekil 2.2: Modern kriyoterapi cihazı ve uygulama ucu… 37

Şekil 2.3: Farklı tipteki srey uygulama uçları 38

Şekil 2.4: Sıvı nitrojen tankları 39

Şekil 2.5: TC – pirometre sistemi 40

Şekil 3.1: Deneklerde cerrahi için hazırlanmış alan… 49

Şekil 3.2: Deneklerde tibianın medial yüzeyinin açığa çıkarılması 50

Şekil 3.3: Serum irrigasyonu altında kemik defekti açılması 50

Şekil 3.4: Defekt bölgesine sıvı nitrojen uygulaması 51

Şekil 3.5: Defekt bölgesine karbondioksit gazı uygulaması 51

Şekil 3.6: Defekt bölgesinin kapatılması 51

Şekil 3.7: Cry-Ac sıvı nitrojen spreyi ve uygulama probu(Brymill, USA) 52

Şekil 3.8: MC-106 kriyoterapi cihazı ve uygulama probu(Bimed, ANKARA) 52

Şekil 4.1: Defekt bölgesinde damardan zengin bağ dokusu içinde yeni kemik yapımı 56

Şekil 4.2: Defekt bölgesinde kırık ucu altından başlayan yeni kemik yapımı 57

Şekil 4.3: Kırık uçları arasında defekt bölgesini büyük ölçüde kapatan köprü

biçiminde yeni kemik yapımı 57

Şekil 4.4: Kırık uçlarından başlayan yoğun kemik yapımı 58

Şekil 4.5: Defekt bölgesini köprü biçiminde kapatan yeni kemik yapımı 58

Şekil 4.6: Defekt bölgesinde lameller biçim almış ve arada kemik iliği oluşmuş

kemik köprüsü… 59

Şekil 4.7: Defekt bölgesinde, fibröz doku altında, kırık uclarından başlayan

yeni kemik trabekülleri 60

Şekil 4.8: Defekt bölgesinde nekrozun yerini alan fibröz kallus ve çevrede

kondral kemikleşme alanı 61

Şekil 4.9: Defekt bölgesinde kırık uçlarından gelişen kemik yapımı ve ortada

fibröz kallus 61

Şekil 4.10: Defekt bölgesini kapatma yönelik kemik köprüsü altında nekrotik

kemik adacığı 62

Şekil 4.11: Defekt bölgesinde yüzeydeki fibrokartilaj doku altında defekti

kapatan trabeküler kemik yapımı 62

Şekil 4.12: Defekt bölgesinde nekroz alanları ve kemik iliği aralığında kanama alanları 63

Şekil 4.13: Defekt bölgesinde geniş koagülasyon nekrozu alanı 64

Şekil 4.14: Defekt bölgesi komşuluğunda medüller bölgede fibröz çeper

ile sınırlı mikroabse odağı 64

Şekil 4.15: Defekt alanı çevresinde nekroz bölgesini sınırlar tarzda kemik yapımı 65

Şekil 4.16: Defekt bölgesinde nekrozun yerini alan, fibrin demetleri içeren gevşek yapıda bağ dokusu ve bu alan çevresinde bölgeyi sınırlayan yeni

kemik yapımı 66

Şekil 4.17: Defekt bölgesini dolduran gevşek yapıda bağ dokusu çevresinde yeni kemik yapımı 66

Şekil 4.18: Defekt bölgesi büyük ölçüde dolduran kemik trabekülleri arasında

varlığını sürdüren kıkırdak adacığı 67

SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ

BMP : Bone morphogenetic protein, kemik morfogenetic proteini IGF : Insuline-like growth factor, insüline benzer büyüme faktörü TGF : Transforming growth factor, dönüştürücü büyüme faktörü

PDGF : Platelet derived growth factor, trombosit kaynaklı büyüme faktörü IL : Interloucin, İnterlökin

TNF : Tumour necrosis factor, tümör nekroze edici faktör PTH: Parathormon

GAG : Glikozaminoglikan

ECM : Extracelluler matrix, ekstrasellüler matriks

FGF : Fibroblast growth factor, fibroblast büyüme faktörü NGF : Nerve growth factor, sinir büyüme faktörü

EGF : Epidermal growth factor, epidermal büyüme faktörü

CDGF : Condroblast derived growth factor, kondroblast kaynaklı büyüme faktörü MDGF : Macrophage derived growth factor, makrofaj kaynaklı büyüme faktörü ECGF : Endothelial Cell Growth Factor, endotelyal hücre büyüme faktörü

PMN : Polimorphonuclear leucosit, polimorfonüklear lökositler

VEGF : Vascular endothelial growth factor, vasküler endotelyal büyüme faktörü ATA : Atmosphere absolute, mutlak atmosfer

MSC : Mesencimal stem cells, mezenkimal kök hücreler HA: Hidroxiapatite, hidroksiapatit

TCP : Tricalcium phosphate, trikalsiyum fosfat CO2 : Corbondioxide, karbondioksit

N2O : Nitrous oxide, nitroz oksit N2 : Nitrogen, nitrojen

Ar : Argon, Argon

TC : Thermocouple, soğuğa hassas hipodermik iğne

ÖZET

XXXXXXX, B.A. (2006). Deneysel olarak oluşturulan kemik defektlerinde iki farklı kriyojen madde olan sıvı nitrojen ve karbondioksit gazı uygulamasının kemik iyileşmesi üzerine olan etkilerinin histopatolojik olarak değerlendirilmesi.

Çalışmamızda iki farklı kriyojen madde olan sıvı nitrojen ve karbondioksit gazının kemik dokusu iyileşmesi üzerine olan etkilerini histopatolojik olarak değerlendirmeyi amaçladık.

Çalışmamızda 126 adet Wistar-Albino cinsi 240±20 g ağırlığında 13 haftalık denek kullanılmıştır. 63 denekten oluşan iki ana grup, sakrifikasyon günleri olan 3, 7, 14, 21, 28, 45 ve 60 olmak üzere 7 alt gruba ayrılmıştır. Deneklerin tamamının sağ ve sol tibialarında 5 mm uzunluğunda, 3 mm genişliğinde, kemiğin kortikal ve kansellöz kısımlarını içeren defektler hazırlanmıştır. Deneklerin sağ ve sol tibialarına kemik defekti açılıp sol tibial defekte sıvı nitrojen, sağ tibial defekte karbondioksit gazı uygulanmıştır. Diğer ana grup konrol grubu olarak tibialarında defekt yaratılıp doğal iyileşme sürecine bırakılan deneklerden oluşmaktadır. Çalışmamızda, kemik iyileşmesi operasyondan sonraki 3, 7, 14, 21, 28, 45 ve 60. günlerde histopatolojik olarak değerlendirilmiştir.

Histopatolojik değerlendirmeler sonucu elde edilen verilerin istatistiksel değerlendirilmesinde sıvı nitrojen ve karbonioksit gazı uygulanan kemik defektlerinde aseptik nekroz alanları görülmüş, bu alanların kontrol grubuna oranla istatistiksel olarak anlamlı derecede daha fazla olduğu saptanmıştır. Bu alanların yeni kemik yapımına engel olmadığı ama kemik iyileşmesinin her iki grupta da kontrol grubuna oranla istatistiksel olarak anlamlı derecede uzamasına neden olduğu görülmüştür. Bu bilgiler ışığı altında kriyoterapinin lokal agresif lezyonların sıklıkla görüldüğü maksillofasiyal bölgede rezidivlerin önlenmesi amacıyla güvenle kullanılabileceğini, bu çalışmanın da ileride yapılacak olan klinik ve deneysel çalışmalara temel oluşturabileceğini düşünmekteyiz.

Anahtar kelimeler : Kriyoterapi, kemik iyileşmesi, sıçan

ABSTRACT

XXXXXXX, X.X. (2006). The histopathological effects of two cryogen agents liquid nitrogen and carbon dioxide on the healing of experimental bone defects.

We aimed to evaluate the histopathological effects of liquid nitrogen and carbon dioxide on the healing of experimental bone defects in our study.

126 Wistar – Albino male rats , weighing 240g±20 g were used in this study. Rats were equally divided into two main groups and into 7 sub groups due to the scarification dates respectively 3, 7, 14, 21, 28, 45 and 60 days. 5 mm long and 3 mm wide cortıco-cancellous bone defects in both left and right tibia of each rat are done. Liquid nitrogen was applied on the left tibia and carbondioxide on the right side. The other main group is the control group. We evaluated the histopathological effects on the bone at the 3rd, 7th, 14th,21st,28th,45th and 60th days according to the scarification times.

According to the statistically evaluated data from the histopathological findings, there are aseptic necrosis fields in both liquid nitrogen and carbondioxide group and these are significantly much more than the control group. Due to the necrosis amount the healing of bone in each group is significantly delayed in contrast to the control group. Regarding to this findings we suggest that the use of cryotherapy in the maxillofacial region where especially locally aggressive lesions are usually seen can be safely done to avoid the generally seen residives and this study may provide a baseline for further clinical and experimental research.

Key words : Cryotherapy, bone healing, rat

1. GİRİŞ VE AMAÇ

Biyomekanik ve metabolik yönden vücut için önemli olan iskelet sistemi; kemikler ve onları birbirleri ile bütünleştiren bağ dokusundan oluşmuştur. Kemik, bu sistemin ana bileşenidir; bağ dokusundan sağlamlık ve bütünlük olarak ayrılmıştır. Kemik; bir çatı içerisine entegre hücrelerden oluşmuş, dinamik ve biyolojik yönden aktif bir dokudur. Bu rijit yapı, vücudun şeklini muhafaza etmesini sağlar(101). Bu yapısal bütünlük gençlikten yaşlılığa kadar birçok çevresel etkene maruz kalır. Bu özelliği dikkate alındığında, kemik dokusunda iyileşmenin, çok sayıda biyokimyasal, biyomekanik, hücresel, hormonal ve patolojik süreçler tarafından etkilendiği bildirilmiştir(14).

Kemik kendi kendini onarabilen, kütlesini, şeklini ve özelliklerini mekanik ihtiyaçlara göre adapte edebilen bir yapıdan oluşmuştur. İskelet sistemini oluşturan kemik dokusunun devamlılığının veya direncinin çeşitli nedenlerden dolayı bozulabileceği belirtilmiştir(6,43,58). Bozulan bu yapının fonksiyon ve estetik olarak eski haline dönüştürülmesi için bir çok yöntem kullanılmıştır(8,34,45). Bu yöntemlerin hepsinin temel amacı; bu bölgenin yeni kemik yapımıyla eski fonksiyon ve estetik yapıya kavuşturulmasını sağlamak olmuş ve bunun için lokal veya sistemik olarak etkili ilaçlar ve materyaller kullanılmıştır(87,174). Lokal olarak kullanılan materyaller kemik greftleri ve biyomateryaller iken sistemik olarak kullanılanlar osteoblastik aktiviteyi artırıp osteoid madde yapımını artıran ilaçlardır(11).

Geniş kemik defektlerinin tedavisinin, altın standart olarak tanımlanan, verici bölgeden alınıp defekt bölgesine yerleştirilen otojen greft materyalleri ile mümkün olabileceği düşünülmüş, verici bölgenin morbiditesi ve alınan materyalin sınırlı miktarda olması araştırmacıları bu tedavinin alternatifini bulmaya yönlendirmiştir(45). İdeal kemik materyalleri güçlü, kolay elde edilebilir, osteokondüktif, osteoindüktif, kolay uygulanabilen ve ucuz olmadır. Bunların yanında materyal, üzerine uygulanacak işlemleri tolere edebilmeli, yerleştirilecek hücreler ve mediatörler için iyi bir taşıyıcı olmalıdır. Bu özelliklerin tamamını barındıran bir materyal henüz bildirilmemiştir(6,175).

Modern dişhekimliğinin amacı, stomatognatik sistemi ilgilendiren atrofi, hastalık veya travmanın yol açtığı doku kaybında fonksiyon, konfor, estetik ve sağlığın yeniden yapılandırılarak bireylere iade edilebilmesini başarmaktır. Özellikle 1970’li yılların başından itibaren hekimler hasar görmüş dokuların yapı ve fonksiyonlarını tekrar geri kazandırmak için çok çeşitli teknikler geliştirmişlerdir(8). Bazı durumlarda uygulanan cerrahi müdahaleler sonrasında kalan dokuların rekonstrüksiyonunun hem hekim hem de hasta açısından tatmin edici olmadığı bildirilmiştir(14,93). Marjinal veya geniş rezeksiyonun endike olmadığı ama metastazlar ve tümörün lokal kontrolünde uygulanacak yöntemlerin gerekliliği savunulmuş, bu amaçla marjinal rezeksiyona oranla daha avantajlı, destek kemik dokusunun maksimum düzeyde korunmasını sağlayacak ve operasyon sonrasında uygulanacak olan plastik cerrahi sınırlarını minumuma indirecek tedavi seçenekleri düşünülmüştür(16,75,195). Bunların başında hedeflenen dokuların soğutularak nekroze edilmesi prensibine dayanan, kriyojenik ajanların doku ile direkt veya indirekt olarak temas ettirilmesi suretiyle yapılan kriyoterapi gelir(20,51).

Kriyoterapi, doku nekrozu yaratmak için soğuğun teröpatik olarak kullanılmasıdır(52),. Lokal soğuk uygulamasının kullanılmasına dair ilk bildiri değişik doku lezyonlarında tuz-buz karışımının Dr.Xxxxx Xxxxxx tarafindan 1850 yılında yapılmış, bu karışımın belirgin anestezik ve hemostatik etkisi ile kullanımını baş ağrısından serviks kanserlerine kadar önerilmiştir(28,44).

Xxxxx X. Xxxxxxx 1968 yılında primer ve metastatik kemik tümörlerinin tedavisi için ortopedide kriyoterapiyi kullanmaya başlamıştır(111,156,193).

19.yüzyıldan itibaren kriyoterapi nörocerrahi, jinekoloji, üroloji ve oftalmolojide kullanılmıştır. Katı karbondioksit, soğuk hava akımı, nitröz oksit, argon gazı ve sıvı nitrojen değişik birçok malign ve selim lezyonların tedavisinde başarıyla kullanılmıştır(68,74,85,92,151).

Oral cerrahi alanında, ameloblastoma, miksoma, keratokist ve santral dev hücreli granüloma gibi lokal agresif lezyonlar veya eozinofilik granüloma ve fibröz displazi gibi rezidiv ihtimali yüksek tümörlerle sıklıkla karşılaşılır(8,64,179). Bu tip lezyonlarda geleneksel tedavi yaklaşımı küretaj, marjinal rezeksiyon ve gerektiği durumlarda operasyon sonrası uygulanan

kemoterapi ve radyoterapidir. Güncel prensipler içerisinde bu yaklaşımlara ek olarak, lokal uygulanabilen çeşitli tedavi metodlarına yer verilmiş, araştırmacılar tümör yatağına fenol, polimetilmetakrilat, Xxxxxx solüsyonu, lazer veya kriyoterapi uygulamışlardır(22,60,80,107,113,123)

Bahsedilen bu tedavilerin arasında kriyoterapinin diğer tedavi metodlarına kıyasla sistemik herhangi bir yan etkisinin olmaması, hasta ve hekim için toksik olmaması, etkinliğinin fazla olması ve bunlardan daha önemlisi dozunun ayarlanabilip çeşitli tipteki ve lokalizasyondaki kemik tümörleri için özelleştirilebilir olması gibi önemli avantajlara sahip olduğu bildirilmiştir(55,84,141).

Yapılan in vitro ve in vivo çalışmalarda, kriyoterapi sonrası mezenkimal kök hücrelerinin osteojenik potansiyelinin kaybolmadığı, yeni oluşacak kemik için matriks oluşturacak yapıyı sağlam bıraktığı, bu sebepten dolayı da diğer tedavi prensiplerine oranla benzersiz avantajlara sahip olduğu bildirilmiştir(64,98). Kemik içi lezyonlara uygulandığında kriyojen maddeler kemiği devitalize ederken inorganik bütünlüğünü bozmamaktadır(112). Rejenerasyon Xxxxxxxxx’in belirttiği “creeping substitution” denilen temele göre gerçekleşir(146).

Çalışmamızda lokal olarak uygulanan iki farklı kriyojen madde olan sıvı nitrojen ve karbondioksit gazının deneklerde oluşturulan kemik defektlerinin iyileşmesi üzerine olan kısa ve orta dönem etkilerini histopatolojik olarak incelemeyi amaçladık.

2. GENEL BİLGİLER

2.1. Kemik Dokusu

İnsan vücudu; hareket sisteminin iskeletini oluşturan kemikler ile bu kemikler arasında hareketlerin gerçekleştirildiği eklemler, kaslar ve bunların koordinasyonunu sağlayan kan, sinir, epitel, lenfatik doku, myeloid doku(kemik iliği) ve yağdan oluşur(11). Bu yapılardan kemikler ve eklemler hareketin pasif unsurlarını oluşturdukları halde kaslar, motor yani aktif unsurlarını oluşturur.

Kemik dokusu, yapısında bulundurduğu farklı hücrelerin ve ara maddenin üzerine organik ve inorganik tuzların çökeldiği, bu sayede sağlamlık ve esneklik gibi fiziksel özellikler kazanmış ileri derecede özelleşmiş bir bağ dokusu türüdür(12). Kemik bir kaldıraç sistemi oluşturup , çizgili (iskelet) kas kasılmalarının doğurduğu kuvvetleri arttırarak bunları bedensel hareketlerle dönüştürür(119). Kemik dokusu farklı görevlere sahiptir. Şekilleri, boyutları ve hatta görünümleri bu görevleri yerine getirebilmek için değişiklik gösterir. Yapısal olarak uzun kemikler, kısa kemikler ve yassı kemikler olarak üçe ayrılır(101). Uzun kemikler yapı itibarı ile boylamasına bir eksene sahiptir ve uç kısımları genellikle eklemden oluşur. Femur ve humerus iyi bir örnektir. Kısa kemikler küp veya kutu şeklindedir. El ve ayak bileğindeki karpal ve tarsal kısa kemik örnekleridir. Yassı kemikler kısa, ince ve genellikle kavisli bir yüzeye sahiptir. Kafatasının bazı kemikleri, kaburgalar ve sternum tipik düz kemiklerdendir(163).

Kemik dört mikroyapısal bileşkene bölünebilir(93);

• Hücreler

• Organik matriks

• İnorganik matriks

• Çözünebilen sinyal faktörleri

Mikroyapısal bileşenlere periost ve endost tabakaları da dahildir.

Bu mikroyapısal bileşenler iki farklı makroyapıya dönüşür;

• Kortikal kemik

• Kansellöz kemik

2.1.1 Kemik dokusunun mikroyapısal bileşenleri

Kemiğin mimarı yapısının oluşmasında, rezorpsiyonunda ve bu yapının devamlılığının korunmasında farklı hücreler görev alır. Kemikte herbiri ayrı fonksiyona sahip iki farklı soyda hücre vardır(115);

• Osteojenik hücreler

• Osteoklastlar

Osteojenik hücreler kemiğin oluşmasından ve devamlılığının korunmasından sorumlu olan osteoprogenitörler, preosteoblastlar, osteoblastlar, osteositler ve kemik yüzeyini döşeyen hücrelerden oluşur(77,95).

2.1.1.1 Osteoprogenitör Hücreler

Mezenkim kaynaklı ana hücrelerin bir alt grubudur. Mitoz yeteneğine sahip olup, olgun kemik hücrelerine farklılaşma kapasitesine sahiptir(77). Bu hücreler kemik yüzeyinde, periostun iç yüzeyinde, endostta ve kompakt kemiğin vasküler kanallarında bulunur. Elektron mikroskobu ile yapılan çalışmalar sonucunda iki tip osteoprogenitör hücre saptanmıştır. Bunlardan birincisi gelişmemiş endoplazmik retikulum ve az gelişmiş golgi cisimciği ile tanınan preosteoblastlardır. Bu hücrelerden osteoblastlar gelişir. Diğerleri ise belirgin mitokondri ve serbest ribozomları ile tanınan hücrelerdir(159). Bu hücreler ise osteoklastlara öncülük eder. Özelleşmiş kemik hücreleri kemiğin oluşumundan, rezorbsiyonundan ve kemik yapısının devamlılığını sağlamaktan sorumludur(42).

Osteoprogenitör hücreler tüm yaşam boyunca kondroblast, osteoblast ve osteoklastlara farklılaşma potansiyellerini korurlar. Kemik hücrelerinin kökeni sorusu geçmişte tartışılmıştır. Kemikteki iki ana hücre olan osteoklastlar ve osteoblastlar, kaynağını hemopoetik ve stromal hücre sistemi olarak adlandırılan iki farklı hücre soyundan alır(32,35,41)(Şekil 2.1).

→ Lenfositler

→ Eritrositler

→ Megakaryositler

Hemopoetik kök hücreler → Granülositler

→ Monositler

i. Makrofajlar

ii. Dev hücreler

iii. Osteoklastlar

→ Endotelyal hücreler

→ Retiküler hücreler

Stromal kök hücreler → Fibroblastlar

→ Osteojenik hücreler → Osteoblastlar

↓

Osteositler

Şekil 2.1: Kemik hücrelerinin kökeni

2.1.1.2. Osteoblastlar

Mezenkimal hücre soyundan gelişir. Differansiyasyona uğramamış mezenkimal hücrelerden son safha osteoblasta geçiş kararlı, osteoprogenitör hücrelerden ve indüklenebilen osteoprogenitör hücrelerden olmak üzere iki farklı yol ile gerçekleşir. Kararlı hücreler hücre yoğunlaşmasından ve embriyonel dönemdeki kemik yapımından sorumlu iken, kırık tamirinde çözünebilen morfojenlere neden olan indüklenebilen osteoprogenitör hücreler görülür(33,153).

Cerrahi müdahale veya travma sonrasında kemik yaralandığında lokalize hücreler embriyojenik safhaları taklit ederek kemiğin formunu ve fonksiyonunu korumaya çalışırlar(125). Lokal hücreler periost, endost ve dura içindeki kararlı osteopregenitör hücreler ve gelişmekte olan kapiller filizler içinde travma sonrası 3 ila 5. ci günde bölgeye gelen perisit gibi indüklenebilen hücrelerdir. Perisitler ayrıca endojen kemik morfogenetik proteinleri(bone morphogenetic proteins,BMP) ile reaksiyona girerek osteoblastlara dönüşebilir(142).

Kemik iliğindeki mezenkimal kök hücreler de tamir prosesindeki hücrelere yardım eder. Bu multipotansiyel hücreler beslenme, spesifik büyüme faktörleri, damarlanma ve mekanik stabilite gibi çevresel koşullara bağlı olarak kıkırdak oluşturacak kondrositlere veya kemik oluşturacak osteoblastlara dönüşebilir(41).

Elektron mikroskobunda osteoblastların çok sayıda girintili çıkıntılı endoplazmik retikulumları, bol serbest ribozom ve poliribozomları olduğu görülür. Golgi bölgesi gelişmiştir ve mitokondriler çok sayıdadır. Geniş ovoid çekirdek dış merkezli olarak yerleşmiştir. Hücre yüzeyinde az miktarda kısa, mikrovilluslar vardır(101).

Osteoblastlar metabolik olarak aktif salgılayıcı hücrelerdir. Osteoblastlar

%90 oranında Tip I ve az miktarda Tip V kollajen salgılamalarının yanı sıra kemik mineralizasyonu için önemli olan, kollajen yapıda olmayan proteinler ve sitokinler de salgılarlar; çözünebilen sinyal faktörleri( kemik morfogenetik proteini(BMP), dönüştürücü büyüme faktörü(TGF), insülin benzeri büyüme faktörleri (ILGF), interlökin(IL), trombosit kaynaklı büyüme faktörleri PDGF), osteoid(yoğun olarak tip I kollagen içeren organik çözünmeyen yapı). Bu faktörler hücre metabolizmasını düzenler. Sitokinlerin çeşitliliği ve sayısı osteoblast ve osteojenik prekürsörlerinin fizyolojik durumlarına göre değişiklik gösterir. Kemik hücreleri ve prekürsörlerinin artışı büyüme faktörleri ile etkileşimleri ile yakından ilişkilidir(46,115).

Osteoblastların aktif yaşam ömrü 1-10 hafta arasındadır; bazıları kemik yüzeyini döşeyen hücrelere, %15 lik bir kısmı da osteosite dönüşür. Bu dönüşümün nasıl olduğu belirgin değildir(153).

2.1.1.3. Osteositler

Osteoblastlar, kemik trabeküllerinin yüzeyinde yer alarak osteoid sentezlerler. Kemik matriksi olan osteoid kalsifikasyona uğrayarak hidroksiapatit kristallerini oluşturur. Bu süreç sırasında bazı osteoblastlar kemik içinde kalarak osteosite dönüşür(35). Kemik canlılığı ve iç denge için çok kritik olan osteositler, metabolik açıdan osteoblastlara oranla inaktif hücrelerdir. Osteosite dönüşen osteoblastların sayısı kemik oluşum hızına bağlıdır. Oluşum hızı arttıkça bölge hacmi içinde kalan osteosit sayısı da artar(21,163). Genel bir kural olarak embriyonik/ağsı (woven) kemik veya tamir kemiği lameller kemiğe göre daha fazla sayıda osteosit içerir. Oluşumlarının ardından osteositler yavaş yavaş matriks üretme yeteneklerini kaybederler ve boyut olarak küçülürler. Zaman içinde çevrelerindeki matriksi rezorbe ederek osteositik lakünleri oluştururlar. Osteositler matriks lamelleri arasında bulunan lakünalar içerisinde bulunur(93). Her lakünada sadece bir osteosit vardır Osteositler osteoblastlarla kıyaslandığında yassı elips şeklindedir. Küçük çekirdekleri ve az sayıda mitokondrili seyrek sitoplazmaları vardır ve golgi kompleksleri ve endoplazmik retikulumları dikkati çekecek kadar küçülmüştür. Çekirdek kromatinleri daha yoğundur. Bu hücreler kemik matriksinin devamlılığında aktif rol alırlar(125)

Kemiğin canlılığı, kemik içinden geçen ve birbirleri ile ilişki halinde olan kanalikulilerin içinde meydana gelen, osteositik sitoplazmik işlemler bütünlüğü içinde sağlanır. Bu yapı, osteositlerin boşluklar sayesinde birbirleriyle ilişkili olmalarını, osteoblastlara sinyal iletimini ve osteoblastlardan da osteositlere iletimini sağlar(115). Osteosit, osteoblast ve osteoklastların birbirleriyle reaksiyonları tam olarak açıklanamamıştır. Ama bu üç hücre kalsiyum regulasyonunda, kemik hemostazında, şekillenme ve yeniden şekillenme aşamalarında yönetici rol oynarlar(153).

Osteositlerin yaşam ömrü birkaç yıldır. Osteositler son üründür ve yenilenemezler. Popülasyonun devamı osteoblast prekürsor hücrelerinin differansiyoasyonu sonucu olur(101).

2.1.1.4. Osteoklastlar

Kemik iliğinde bulunan granülosit-makrofaj prekürsorları dolaşıma monosit olarak katılırlar ve bazı senkronize olmayan füzyonlar sonucu osteoklast olarak bilinen 100µm’luk çapa kadar ulaşabilen ve yaklaşık 10-12 çekirdek ihtiva eden dev hücrelere dönüşürler. Makrofajlardan farklı olarak kıvrımlı sınırları, kalsitonin reseptörleri vardır ve asit fosfataz üretirler(153).

İnterlökin 1,3,6 ve 11, tümör nekroze edici faktör alfa(tumour necrosis factor, TNF-α) ile birlikte dönüştürücü büyüme faktörü alfa(TGF-α) osteoklast gelişiminde önemli rol oynar. Tam olarak hangisinin veya hangilerinin daha etkin olduğu bilinmemekle birlikte İnterlökin 11’in burada temel faktör olduğu düşünülür(83). Çözünebilen faktörler ile osteoblast ve osteoklast formasyonu arasında bir etkileşim olduğuna dair kanıtlar vardır. 1,25-dehidroksivitamin D3 osteoblastlara bağlanarak progenitör hücrelerine etkili osteoklast differansiyasyon faktör salınıma neden olur. Bu sebeple osteoblastik hücreler osteoklast formasyonu ve oluşumu için kofaktör yaratan bir kaynak olarak düşünür(11).

Morfolojik olarak çok çekirdekli bir dev hücreyi osteoklast olarak tanımlayabilmek için kemiğe tutunmalı ve kıvrımlı bir sınır göstermelidir(101). Bu yapı altında osteoklast kaynaklı bir rezorpsiyondan bahsedilebilir. Paratiroid hormona cevap olarak osteoblastlar kemik yüzeyinden dağılınca, açığa çıkmış mineralize olan osteoid, osteoklastlara iyi bir tutunma alanı sağlar. Tutunma, yüzey adezyon molekülleri ve proteinler arasında olur. Tutunma çevresi tutunma alanı olarak adlandırılır ve bu bölgede kıvrımlı bir sınır gelişir. Bu yapı geçişe ve iletime olanak verir(100).

Bu kıvrımlı yapı kemik yüzeyinin enzimatik yıkımının gerçekleştiği osteoklastların rezorbe edici alanını oluşturur ve asit fosfataz, aril-sülfataz, b-glukoronidaz, b-gliserofosfatazmetalloproteaz, kollagenaz ve sirtomolizin gibi birçok enzim içeren bir prosestir(119). Kıvrımlı sınır ve kemik yüzeyi arasında kalan bu tutunma alanı, bu alanı etraftan ayırarak karbonik anhidraz gibi ortam pH’ını düşürebilen enzimlerin etkili olmasına ve böylelikle kalsiyum ve fosfattan oluşan inorganik matriksin çözünüp bu proteolitik enzimlerle temasına

olanak verir. Organik bileşenlerin sellüler değişimini takiben howship lakünü olarak bilinen rezorpsiyon kaviteleri ortaya çıkar(153).

Bu rezorpsiyon aktivitesi tam olarak açıklanamamış mekanizmalarla kontrol edilmektedir. Ama sellüler aktivasyon, sellüler cevaplar, faktör ekspresyonu, aktivitenin durması ve apoptosisin, osteoblastlar ve osteoklastlar arasındaki dinamik iletişim sayesinde olduğuna dair kanıtlar mevcuttur(109).

In vitro olarak paratiroid hormon(PTH) ve 1,25-dihidroksivitamin D3 bulunan kültürlerde bu hücrelerin tek başına kemik rezorpsiyonu yapmadıkları lakin ortama ilave edilen osteoblast sonrasında rezorpsiyona neden oldukları bildirilmiştir(coupling mekanizması)(115).

2.1.1.5. Kemik yüzeyini döşeyen hücreler

Osteoblastların, kemik oluşturma işlemlerini gerçekleştirmedikleri zamanlarda istirahat halinde oldukları kabul edilir. Kemik yüzeyini kaplayan yassı, ince ve uzun görünümlü bu hücreler kemik yüzeyini döşeyen hücrelerdir. Erişkin iskeletinin büyük bir kısmını örterler(102). Potansiyel osteoblast kaynakları arasında oldukları, kemik ve ekstrasellüler sıvı kompartmanı arasında bariyer oluşturdukları ve kemikte yeni kemik oluşumunun veya rezorpsiyonunun hangi bölgede gerçekleşeceğini düzenledikleri tahmin edilir(71).

2.1.1.6. Matriksler

Organik ve inorganik tuzlardan oluşur. İnorganik maddeler, kemiğin kuru ağırlığının %60'ını oluşturur. İçeriğinde özellikle kalsiyum ve fosfat daha fazla olmakla beraber bikarbonat, sitrat, magnezyum, potasyum ve sodyum bulunur. Röntgen ışını difraksiyon yöntemi ile yapılan çalışmalarda kalsiyum ve fosforun Ca10(PO4)6(OH)2 kompozisyonunda birleşerek hidroksiapatit kristallerini meydana getirdiği görülmüştür. Burada önemli miktarda amorf, kristal yapıda olmayan kalsiyum fosfat vardır(81,101). Elektron mikrograflarda

kemik hidroksiapatit kristalleri yaklaşık 40x25x3 nm. boyutlarında plakalar halinde görülür. Hidroksiapatitin yüzeyindeki iyonlar suya doyurulduğu için kristalin etrafı su ve iyonlardan oluşmuş bir tabaka halinde kaplanmıştır. Hidrasyon kabuğu adı verilen bu tabaka vücut sıvıları ile kristal arasındaki iyon alışverişinin gerçekleşmesini kolaylaştırır(45).

Organik madde Tip I kollajenden ve proteoglikan çökeltilerini içeren, kollajen kısımları birbirine bağlayan glikoz aminoglikanlardan oluşur. Kollajen molekülleri 400 A○ lık gözenekler oluşturacak şekilde dizilir. İnorganik kısmı meydana getiren tuzlar bu gözeneklerde yer alır(159).

Kemik siyaloproteini ve osteokalsin, kalsiyuma sıkıca bağlanabilmelerini sağlayan ve olasılıkla kemik matriksinin kalsifikasyonunu başlatmaktan sorumlu olan birkaç γ –karboksiglutamik asit kalıntısı içermektedir. Normalde Tip I kollajen içeren diğer dokular kalsifiye olmaz ve bu proteinleri içermez. Kollajenden zengin olduğu için, dekalsifiye edilmiş kemik, kollajen boyaları ile koyu olarak boyanır(130).

Hidroksiapatit ile kollajen lifleri arasındaki ilişki, kemiğin özelliği olan sertliğinden ve dayanıklılığından sorumludur. Kemik dekalsifiye edildikten sonra şeklini korur ancak bir tendon kadar esnek hale gelir. Çoğunluğu kollajenden oluşan matriksin organik kısımlarının ortadan kaldırılması halinde kemiğin orijinal şekli bozulmaz ancak kolayca kırılabilir hale gelir(173).

2.1.1.6.1 Organik matriks

Kemiğin kuru ağırlığının yaklaşık %35’i organik matrikstir. Tip I kollagen ana bileşendir(%90) ve kalanı da(%10) non kollagen bileşenlerdir. Kemik mühendisliği disiplininin gelişmesinde en önemli kısım non kollagen kısım olmuştur. BMP’ler, non kollagen bileşene iyi bir örnektir(100).

Non kollagen bileşenler, proteoglikan ve glikoprotein olarak ikiye ayrılmıştır. Proteoglikanlar, glikozaminoglikanlardan(GAG) oluşur. GAG’lar sülfate olmuş tekrarlayan karbohidrat üniteleridir; kondrotin sülfat, dermatan sülfat, keratan sülfat ve heparin sülfat. Proteoglikanların büyüme faktörleri

regülasyonuna katıldıkları düşünür. Glikoproteinler; osteonektin, fibronektin, vitronektin, fibrilin, osteopontin ve kemik sialoproteindir. Fibronektin temel ekstrasellüler matriks(ECM) adezyon molekülüdür. Osteopontin ise osteoklastların kemik yüzeyine tutunmalarına yardımcıdır(93).

2.1.1.6.2 İnorganik matriks

Kemiğin mineralize kısmıdır. Kemiğin kuru ağırlığının yaklaşık %60-

%70’ini oluşturur. İnorganik maddelerin içeriğinde özellikle kalsiyum ve fosfat oranı yüksektir. Ayrıca bikarbonat, sitrat, magnezyum, potasyum ve sodyum da bulunur. Röntgen ışını difraksiyon yöntemi ile yapılan çalışmalarda kalsiyum ve fosforun Ca10(PO4)6(OH)2 kompozisyonunda birleşerek hidroksiapatit kristallerini meydana getirdiği görülmüştür(100).

2.1.1.7.Çözünebilen faktörler

Dönüştürücü büyümr faktörü(TGF-ß) iltihap ve doku tamirinden sorumludur. Tüm hücreler moleküler formlarının birinde TGF-ß oluşturur ve bu faktörün reseptörüne sahiptir. TGF-ß kondrosit ile osteoblastlarda sentezlenir ve enkondral kemikleşme sırasında hücre dışı matrikste birikir. Onarım zincirinde rol almak üzere trombositlerden de salınır. Makrofajlardan salınan en güçlü kemotaktik ajandır. Hücrenin integrin reseptörlerini uyarmak yoluyla hücre dışı matriks bileşenlerinden olan kollajen, fibronektin ve proteoglikanların oluşumunu arttırır. Bağ dokusunda hasara yol açan proteolitik enzimleri baskılar ve granülasyon dokusu oluşumuna yol açar(189)

Fibroblast büyüme faktörü (FGF) ailesi, benzer polipeptit yapıda en az on üye içerir. İnsanda en fazla asidik formu(FGF-1) ile bazik formu(FGF-2) bulunur. FGF monositler, makrofajlar, osteoblastlar ve kondrositler tarafından sentezlenir ve birçok mezodermal ve nöroektodermal hücreyi etkiler. Araştırmacılar FGF-2’nin sistemik olarak verildiğinde kırık iyileşmesini

hızlandırdığını, lokal uygulanımının da kemik rejenerasyonunu stimüle ettiğini bildirmişlerdir(10).

Trombosit kaynaklı büyüme faktörü(PDGF), trombositler, monositler, makrofajlar ve endotelyal hücreler tarafından sentezlenir. Mezodermal hücrelerin DNA sentezini ve hücre replikasyonunu stimüle eder. Bunun yanında özellikle fibroblastlar, monositler ve düz kas hücreleri için kemotaktik etkileri de vardır. Lokal olarak uygulanan PDGF’nin hayvan deneylerinde kemik oluşumu üzerine uyarıcı etkileri gözlenmiştir(11). Bunun yanında ektopik kemik oluşumunu da arttırdığı bilinmektedir. İnsanda da immunhistokimyasal yöntemlerle kırık bölgesinde gösterilmiştir. Fibroblast çoğalmasını, mezenkimal hücre mitozunu, monosit ve makrofajların kırık bölgesine göçüne neden olduğu ve. PDGF uygulamasıyla kallus yoğunluğu ve hacmi arttığı bildirilmiştir. Tüm bu sonuçlar PDGF’nin iyileşme sürecinde önemli bir regülatör olduğunu gösterir(36).

Kemik morfogenetik proteinleri(BMP), geniş bir büyüme faktörü ailesi olan ve kültür ortamında fibroblastları dönüştürme yeteneklerinden dolayı Transforming Growth Factor (dönüştürücü büyüme faktörü) β olarak adlandırılan gruba ait alt üyelerdir. BMP ailesi yakın zamanda ayrıştırılan 20’ye yakın proteini içermektedir(53)

Hücrelerin gelişimini ve embriyodaki doku ve organların organizasyonlarını düzenler. Kemik sayısı ve boyutunu, uzuv gelişimini değiştirerek vucut oluşumunu etkiler. Urist son literatürlerinde BMP lerin rolünü “iskelet sisteminin molekülarizasyonu” olarak tanımlamıştır(63).

İnterlökinler(IL), makrofaj ve monosit kökenlidir. IL-I fibroblast çoğalması, kollajenaz ve PGE2 üretimi ile ilgilidir. Ayrıca osteoklastlar üzerine etkileriyle kemik geri emilimini de etkiler(189).

Vücutta pek çok dokuda sentezlenen sinir büyüme faktörü(NGF) periferik sensoryal ve postgangliyonik sempatik sinirlerin gelişimi için son derece önemlidir. Ayrıca lokal uygulanımının kırık iyileşmesi üzerine olumlu etkileri olduğu bildirilmiştir(189).

İnsüline benzer büyüme faktörü(IGF)-I samatomedin, IGF-II ise iskelet büyüme faktörü olarak da bilinmektedir. IGF-II, kemik matriksinde en yoğun konsantrasyonda bulunan büyüme faktörüdür. IGF-I, IGF-II’ye oranla dört ile yedi defa daha güçlüdür. Deneysel çalışmalarda IGF-I’in kemik defektlerinin iyileşmesini hızlandırdığı insanda da IGF-I’ın sistemik olarak verilmesinin kemik oluşumunu hızlandırdığı gösterilmiştir(36,115). IGF-II ise insanlarda kırık iyileşmesinin granülasyon evresinde endotelyal ve mezenkimal hücrelerde gösterilmiştir(45).

Epidermal büyüme faktörü(EGF), kemik yüzeyinden ayrılan hücrelerin remineralizasyonunu hızlandırır(11).

Kondroblast kaynaklı büyüme faktörü(CDGF) iki tiptir. Tip-II kollajen ve hıyalüronik asit için düzenleyicidir(11).

Makrofaj kaynaklı büyüme faktörü(MDGF), osteoblast ve kondrositler için, endotelyal hücre büyüme faktörü(ECGF) de yeni dammar oluşumu için mitojeniktir.(11)

2.1.1.8. Periost

Eklem yüzeyleri dışında kemiğin dış yüzeyini örten bağ dokusu tabakasıdır. Aralarında keskin bir sınır olmayan iki tabakadan meydana gelir; iç tabaka( stratum cambium) ve dış tabaka(stratum fibrosum). Dış tabaka kollajen lifler ve fibroblastlardan oluşmuştur. Yoğun bağ dokusu olup, kan damarları ve lenfotiklere destek sağlar. Demetler halinde kollajen liflerden oluşan sharpey lifleri, matriks içine girerek periostu kemiğe bağlar. Hücreden daha zengin olan periostun iç tabakası bölünüp farklılaşarak osteoblastları oluşturabilme potansiyeline sahip olan yassı hücrelerden yana zengindir. Bu osteoprogenitör hücreler, konumları, yassı şekilleri, çok az miktardaki granüllü endoplazmik retikulumları ve az gelişmiş golgi kompleksleri ile karakteristiktir(45,142).

2.1.1.9. Endost

Kemiğin içindeki bütün boşlukları örter ve tek kat yassı osteoprogenitör hücreler ile çok az miktarda bağ dokusundan oluşur. Bu yüzden endost, periosttan daha incedir. Hem osteojenik, hem de hemopoetik potansiyeli vardır. Büyüme süresince endost aktiftir Osteoklastların kalsiyum gereksinimine bağlı olarak aktivitesi devam eder(142).

Periost ve endostun temel işlevleri; kemik dokusunun beslenebilmesi, büyüyebilmesi ve onarımı için gerekli olan yeni osteoblastları aralıksız olarak sağlamaktır(46). Bu nedenle kemik cerrahisinde periost ve endostun korunmasına çok dikkat edilmelidir.

2.1.1. Kemik dokusunun makroyapısal bileşenleri

2.1.2.1. Primer Kemik Dokusu(Woven Kemik)

Primer kemik, embriyolojik gelişim sürecinde kırık ve diğer nedenlerle ilişkili onarım işlemlerinde ilk ortaya çıkan kemik türüdür. Embriyonik iskeleti oluşturur ve çoğunlukla 4 yaşından sonra normal kemikte görülmez. Geçicidir ve yetişkinlerde, kafadaki yassı kemik eklemleri, diş alveolleri ve tendonların kemiğe tutunduğu yerler gibi birkaç yer dışında yerini sekonder kemiğe bırakır(163).

Oldukça hızlı(günde 30-50 µm) oluşur. Hücrece zengindir ve yeni şekillenmiş düzensiz, rastgele ve değişik yönlere dağılmış ince kollajen lifler içerir. Bu lifler çevre dokulardan kemiğe penetre olur. Woven kemik oldukça az mineral içerir ve mekanik direnci azdır. Lamel içermez ve sekonder kemik dokusuna oranla daha fazla osteosit içerir(130). Olgunlaşmamış yapıdaki bu doku implant iyileşmesinin ilk safhasında oldukça önemlidir(115).

2.1.2.2. Sekonder Kemik Dokusu

Sekonder kemik dokusu genellikle yetişkinlerde bulunur. Kollajen lifler tipik olarak 3-7 µm kalınlığında birbirine paralel ya da vasküler bir kanal etrafında dairesel olarak yerleşmiş lameller şeklindedir(131).

Kan damarlarını, sinirleri ve gevşek bağ dokusunu içeren bir kanal etrafını saran, dairesel lamellerin meydana getirdiği bütünlüğe Havers sistemi yada osteon denir. Osteositleri içeren lakünalar, lamellerin arasında ve seyrek olarak da içinde bulunur. Her lamelde kollajen lifler birbirlerine paraleldir. Her Havers sisteminin etrafı birkaç kollajen lif ve mineralize amorf matriksten oluşan yapıştırıcı madde ile çevrelenir(45). Lameller kemik yetişkin kemiğinde kortikal(kompakt) kemik ve kansellöz(spongiöz yada trabeküler) kemik olarak iki farklı yapıdadır.

2.1.2.2.1 Kortikal kemik

İskelet sisteminin %80’inini oluşturur; kemiklerin dış ve iç tabakalarını meydana getirir. Kortikal kemik vital organları korur, biyofonksiyonel kuvvetlere direnç gösterir, harekete olanak verir ve iç denge için uygun bir kaynak oluşturur(131). Kortikal kemikteki haversian sisteminin(osteon) fonksiyonu biyofonksiyonel kuvvetlere cevap vermek için dahice düzenlenmiştir. Hizzalama diafize paraleldir. Ayrıca santral kanaldan santrifuj doğrultusunda ilerlersek her konsantrik lamel bileşeni ters doğrultuda spiral yapar; saat yönünde ve sonra saatin aksi istikametinde ve böylelikle de baskı ve torsiyon kuvvetlerine en dirençli hale gelir(45).

Her havers sistemi uzun, sıkça dallanan ve diyafizin uzun eksenine paralel olan bir silindir şeklindedir. Bir haversian sistemi yaklaşık 4 ila 20 çevereleyen halkadan meydana gelir ve santral kanalı 22 ila 110 µm’lik çaplarda lameller çevrelerler. Havers sistemleri, dış dairesel lameller, iç dairesel lameller ve interstisyel lamellerden ibaret tipik bir düzenlenim gösterir. Endost ile örtülü her kanal içinde kan damarları, sinirler, ve gevşek bağ dokusu bulunur. Havers

kanalları, yatay yada oblik seyreden Volkman kanalları aracılığı ile kemik iliği boşlukları, periosteum ve kendi aralarında iletişim kurmaktadır. Volkman kanallarının dairesel lamelleri yoktur, lamelleri delerek geçerler(93).

Havers sistemi polarize ışıkla incelendiğinde, parlak anizotropik tabakalar ile karanlık izotropik tabakaların değişimli bir sıra izledikleri görülür. Kollajen liflerin, uzun eksenlerine dik açıyla gelen polarize ışıkta incelendiğinde çift kırıcı(anizotropik) oldukları görülür. Parlak ve karanlık tabakaların birbirleriyle değişimli oluşu kollajen liflerin lameller içindeki yönlerine bağlıdır. Her lamelde lifler birbirlerine paraleldir ve sarmal şeklinde seyrederler. Bununla birlikte sarmalın açıklığı her lamelde farklıdır, bu şekilde komşu iki lamelin lifleri birbirlerine yaklaşık olarak dik açıyla keser. Her lameller halkada bir miktar osteosit bulunur. Bu osteositler aynı lamel içinde kanalikuli denilen çok geniş bir ağ sistemi ile diğer osteositlerle ilişki halindedir. Ayrıca Xxxxxxxx kanalları kortikal kemiğe oblik bir pozisyonda penetre olurlar ve haversian sistemle anastomozlar yapar. Böylelikle metabolik alışveriş, hormonlar gibi çözünebilen sinyaller için vasküler-lenfatik kanallar yaparlar. Kemikte hiç bir hücre herhangi bir damardan 300µm’den daha fazla uzakta bulunamaz ve bu da kemiğin vaskülarizasyonunu gösterir(115).

2.1.2.2.2 Kansellöz kemik

İki kortikal kemik arasında sıkışmış süngerimsi kemiktir. Üç boyutlu trabeküler kafes bu yapının temelini oluşturur. Genel olarak trabeküllerin uzaysal yönlenmesi rastgeledir. Bu aslında kortikal kemiğin biyofonksiyonel yükleme potansiyeli altında beklenmedik birşey değildir. Bazı anatomik bölgelerde mesala iliak kemiğin uç kısmında trabeküller yüklemeye uygun biçimde hizzalanmışlardır. Trabeküler kemik yüklemeye göre gelişmesede fizyolojik uyaranlara çok çabuk yanıt verir. Bunun sebebide kansellöz kemikteki yüzey alanının 20 kat daha fazla olması ve birim alandaki hücre yoğunluğundandır(130,163).

2.1.3. Kemik dokusu embriyogenezi

2.1.3.1 İntramembranöz gelişim

İntramembranöz kemik oluşumu, mezenkim kökenli yoğun embriyonel bağ dokusunun içinde gerçekleşir. Frontal ve pariyetal kemiklerin tamamı, oksipital ve temporal kemikler, mandibula ve maksillanın bazı kısımları intramembranöz kemikleşme ile meydana gelir. İntramembranöz kemikleşmenin kısa kemiklerin büyümesinde ve uzun kemiklerin kalınlaşmasında da rolü vardır(42).

İntramembranöz kemikleşmenin meydana geleceği bölgelerdeki mezenkim hücrelerinde fibroblastlar oluşur. Fibroblast hücreleri kollajen fibrilleri yapar ve membran şeklinde bağ doku alanları meydana getirir. Bu zar oluşumunu takiben yine etraftaki mezenkim hücreleri, kemik hücrelerinin ana hücresi olan osteojenik ve osteoprogenitör hücrelerine dönüşür. Mezenkim yoğunlaşması içinde kemikleşmenin başladığı ilk noktaya primer kemikleşme merkezi denir. Osteojenik ve osteoprogenitör hücreler genişleyip, polihedral bir yapı gösterir ve sitoplazmaları daha bazofilik olur ve artık bunlar osteoblast olarak tanımlanır. Yeni kemik matriksinin oluşmasını kalsifikasyon takip eder, bunun sonucunda bazı osteoblastların etrafları sarılır ve daha sonra bu hücreler osteosit haline gelir. Gelişmekte olan bu kemik adacıklarına histolojik kesitlerdeki görüntülerinden ötürü spikül(iğnecik) adı verilir. Spiküller, aralarında kapillerleri, kemik iliği hücrelerini ve farklılaşmamış hücreleri içeren boşluk uzantılarını saran duvarların kesitleridir. Kemikleşme merkezinde hemen hemen aynı zamanlarda böyle birkaç grup ortaya çıkar ve bunlar birleşerek, zamanla süngerimsi yapıyı meydana getirirler. Kemik spikülleri arasındaki bağ dokusuna, kan damarları ve kemik iliği hücrelerini oluşturacak olan fazla sayıda farklılaşmamış mezenkimal hücrelerin girmesi ile kemik iliği hücreleri meydana gelir(130).

Mezenkimal doku yoğunlaşması içindeki hücreler bölünerek, kemikleşme merkezinin devamlı olarak büyümesinden sorumlu olan, daha fazla sayıda osteoblastı meydana getirir. Birkaç kemikleşme merkezi ışınsal olarak

büyüyüp birleşerek başlangıçtaki orijinal bağ dokusunun yerini alırlar. Bebeklerdeki bıngıldaklar (fontaneller) buna bir örnektir. Bunlar bağ dokusundan oluşan, kafatasının henüz kemikleşmemiş yumuşak bölgelerine karşılık gelmektedirler(115) .

Özellikle doğumdan sonra kafatasının yassı kemiklerinin gerek iç gerekse dış yüzeylerindeki intramembranöz kemik yapımı, kemik yıkımına nazaran belirgin bir üstünlük kazanır. Kafatası gelişime paralel olarak genişlemek zorundadır. Bu nedenle kafatası kemikleri devamlı olarak iç yüzeylerinden osteoklastlar tarafından yıkılmakta, dış yüzeylerinde osteoblastlar tarafından yeni kemik lamelleri eklenmekte ve gelişme sona erdiğinde kompakt kemik şekillenmektedir. Böylece iki tabaka kompakt kemik(iç ve dış tabakalar) ortaya çıkar ama merkezi kısım süngerimsi yapısını korur(131).

Bağ dokusunun kemikleşmeye katılmayan bölümleri ise intramembranöz kemiğin periost ve endostunu meydana getirir.

Mandibula (koronoid prosesin bir bölümü ve midsemfiz bölgesi dışında), kranyum kubbesi( supraperiostal sırttan oksipital perotubetantia’ya kadar), parietal kemikler, oksipital ve temporal kemiklerin squamaz kısımları, squama frontalis, sfenoidin büyük kanadının bir kısmı, ilium, skapula ve klavikulanın intramembranöz kemikleşme geçirir. 7.haftaya kadar klavikula in utero hayatta mineralize olan ilk kemiktir ve hemen bunun ardından mandibula mineralize olur(115).

2.1.3.2. Endokondral gelişim

Embriyojenik yaşamda iskeletin büyük bir kısmı kıkırdaktan oluşur. Bu doku daha sonra rezorbe olur ve kemik ile yer değiştirir. Bu olaya endokondral kemikleşme adı verilir. Bu olay doğum öncesi başlar ve büyüme tamamlanıncaya devam eder(21,36,39,89).

Appendiküler bölgede (kol, bacak, pektoral ve pelvik kemerleri) ve vertebrada hücreler, endokondral kemikleşme için toplanır. Primordial hücrelerin osteojenik bir proses yerine niye endokondral bir büyüme yaptıkları tam belirgin değildir. Bunun nedeninin farklı konsantrasyonlardaki BMP ve lokalize sentezlenen anjiyojenik ve antianjiyojenik faktörler olduğu düşünülür(63,163).

Mezenkimal hücreler vaskülarisazyondan yoksun uzuv merkezlerinde kondrojeniktirler. Embriyogenez sırasında kondrojenik yapıdaki hücreler primer olarak tip II kollagen içeren kıkırdak bir yapı üretir. Çok az miktarda Tip I kollagen (özellikle kemikle ilgilidir), Tip IV kollagen ( özellikle endotelyal bazal lamina) ve Tip X kollagende ( hipertrofik kondrositler ve kalsifiye olmakta kıkırdak) ortamda bulunur(39). Embriyolojik gelişimin uygun zamanında kıkırdak yapı kondrolizi takiben kalsifikasyonun habercisi olarak damarlanır. Kıkırdak alanlarda bulunan antianjiyojenik faktörler damarlanmayı engelledikleri için kıkırdak hücrelerinin ve matriksin kondroliz esnasından ortadan kaldırılması, FGF’lerin preosteojenik bölgelerde yarattığı damarlanmaya meyilli bölge ortamının bir benzerini yaratır. İnterlökin gibi sinyal moleküller sonucu osteoklastik differansiyasyon ve bunu takiben rezorpsiyon başlar. Mineralize kıkırdağın rezorbsiyonunu takiben hematopoietik kemik iliği gelişir ve bu kaviteyide daha sonra kemik formasyonu çevreler(45,81). Vaskülarizasyon ve kalsifikasyonla ilgili hala birçok cevaplanmamış soru bulunmaktadır(71,89).

2.1.4. Kemik dokusu iyileşmesi

Kemik iyileşmesindeki dönemler embriyonel gelişmeyi anımsatır. Rejenerasyon, embriyogenezi hatırlatan kemiğin klasik bir özelliğidir. Bu hasarlı bir kemik dokusunun skar oluşmadan iyileşmesidir. Embriyolojik gelişim ve yara iyileşmesi birçok ortak noktaya sahiptir. Bu sebeple teröpatik yaklaşımlar embriyolojik iyileşmeyi andıran bileşenler içermelidir(71).

Kemik büyümesi, daha önce oluşmuş kemik dokusunun bir bölümünün yıkılırken aynı anda başka bir bölümünün yapımı ile gerçekleşir. Sağlıklı bireylerde kemik yapım hızı kemik yıkım hızından fazladır. Böylece kemik büyürken şekli de korunur. Çocuklarda kemik süratle yeniden şekillenir; yetişkinlere oranla yenilenme 200 kat daha hızlı olabilir. (14).

Dıştan veya içten gelen zorlamalarla kemiğin anatomik bütünlüğünün bozulmasına kırık denir. Fizyolojik reaksiyonlar, bozulan kemik bütünlüğünün yeniden sağlanmasına yöneliktir. Kemik, skar dokusu oluşturmaz ve yeniden şekillenme ile iyileşir. Kırık iyileşmesi kırık oluştuğu andan itibaren başlar, düzenli kemik dokusu ile kırık uçları birleşinceye kadar devam eder. Bir kırıktaki hücreler ve sinyal faktörleri embriyojenik kemik formasyonundakilerle aynıdır (21).

Xxxxxx ve Xxxxxx’x göre sekonder kırık iyileşmesinin üç evresi vardır(46);

• Yangı(Enflamasyon) fazı

• Onarım(Reperasyon) fazı

• Yeniden şekillenme (Remodeling) fazı

2.1.4.1. Enflamasyon fazı

Bu faz, vazokonstrüksiyon, vazodilatasyon, pıhtı oluşumu(hemostaz), fagositoz(lökositoz), yeniden damarlanma ve granülasyon dokusunun sentezini içerir(46).

Bir kemik kırığı matrikste hasara, hücrelerde ölüme, periost ve endostta yırtıklara ve kırık kemik uçlarında yer değişimine neden olur. Travmanın şiddetine bağlı olarak, kırık uçları komşuluğundaki periost ve çevre yumuşak dokular yırtılarak, damarlar yaralanır. Kırık uçlarını karşılıklı çaprazlayan kan ve lenf damarlarının yaralanmasıyla bu uçlar arasındaki kemik iliğinde ve etrafında kan ve lenf sıvısı toplanır. Bu sıvı birikerek periostu kaldırır. Kanamanın pıhtılaşması ile kırık uçları arasında, periost altında ve periost yırtılmışsa bunun etrafında hematom oluşur. Hematom, sağlam yumuşak dokular tarafından sarılır. Hücreler arası iletişim başlar. ECM’nin proteolitik yıkımı sonucu kemotaktik kalıntılar monositleri ve makrofajları yara yatağına doğru çeker. Aktive olan makrofajlar FGF’yi salgılar. Endotelyal hücreler plazminojen aktivatör ve prokollagenez sentezler. Degranulasyona uğramış trombositlerin alfa granüllerinden salgılanan büyüme faktörleri polimorfonüklear lökositler(PMN), lenfositler, monositler ve makrofajlar için yol göstericidirler(102).

Bu dönemde oksijen seviyesinde ve pH derecesinde bir azalma olur, makrofajların ve PMN’lerin görev yapabilecekleri bir ortam yaratılır. PMN’ler mikrobiyal istilayı ve mikrodebrisi uzaklaştırırken makrofajlar birleşerek çok çekirdekli dev hücreler oluşturur. Ayrıca makrofajlar sellüler aktiviteyi, mitozu arttıracak faktörlerin salınmasına neden olurlar(46).

Büyük kırıklarda makrofaj monositler, bütün vücudu etkileyen bir sitokin olan IL-1 salgılar. IL-1 yaralanma bölgesinde lenfositlerin göçünü, kemik geri emilimini sağlar ve orta beyin aracılığıyla ateş meydana getirebilir(115).

Enflamatuar dönem günlerce devam eder, bu sürede hematom organize olur, fagositler ve lizozomal mekanizma ile nekrotik dokular uzaklaştırılır. Fibroblastların bölgeye gelmesi ile onarım fazı başlar(130).

2.1.4.2. Onarım (reperasyon) fazı

Onarım evresi kırık iyileşmesinin en önemli kısmıdır. Kırığı takiben 3 ila

5. günlerde yeni kan damarlarından, kolagen izotiplerinden, ve hücrelerden (fibroblast,makrofaj) oluşan bir tamir dokusu(granülasyon) gelişir(179). Yaklaşık 18 tip kollagen vardır; tip I kemikte, tip II kıkırdakla, III ve V granülasyon dokusu ile, IV ve VI endotelyal matriksle, tip X da hipertrofik kıkırdakla ilgilidir(163). Büyüme faktörlerinin kollagene selektif bağlanması büyüme faktörlerinin hücre-faktör iletişimini optimum hale getirmek için lokalize olmasını ve hatta korunmasını sağlar. Bu sebeple tamir dokusunun kollagen bileşeni TGF-B, FGF, PDGF ve BMP’ler gibi moderate eden faktörler için bir anahtar rol oynar(189).

Bu kollagen yapı farklı sellüler tutunma yerleri ve hücresel iletişimi sağlar. Ayrıca kırık sonrasında periost ve endostta bulunan osteopregenitör hücreler kemotaktik sinyaller sonucu kırık bölgesine gider, granülasyon dokusu kollagenine tuıtunur ve BMP gibi sinyal molekülleri sonucu kondrositlere veya osteoblastlara dönüşür(70).

Hücrelerin farklılaşması, hücrelerin salgıları ile haftalar sonunda ekstrasellüler matriksin olgunlaşması ile kallus oluşur. Kallus bileşenleri vasküler elementler, stromal ürünler, kıkırdak ve hücrelerdir. Kıkırdak, woven kemik ile yer değiştirir. Woven kemik daha sonra kemik segmentelerini güçlendirmek üzere kemik yaprakları gibi tabakalardan oluşan lameller kemiğe dönüşür(45).

Kırık bölgesinde mezenkimal hücre çoğalması ilk 16 saatte saptanmıştır. Bu çoğalma, kırık sonrası 32 saatte en üst düzeye çıkar. Oluşmaya başlayan kan damarları 2-3 günde ışık mikroskobik düzeyde görünür hale gelirler ve birinci haftada belirginleşirler. Kırık iyileşmesinin ilk dönemlerinde periosteal damarlar, geç dönemde ise besleyici damarlar, kılcal damar tomurcuklanmasına yardımcı olurlar. Fakat kılcal damar gelişimi osteojenik hücre çoğalması kadar hızlı olmadığından, beslenmenin daha iyi olduğu kemiğe yakın seviyedeki hücreler, osteoblastlara dönüşür. Kemiğe yakın olmayan, granülasyon dokusu kuşağının üzerinde yerleşen hücreler dolaşım yönünden fakirdir. Bu bölgedeki

kılcal damarların gelişim hızı, hücre çoğalmasının hızına uyum gösteremediğinden, hücreler kondroblast ve kondrosite farklılaşarak kıkırdak dokuyu oluşturur(21)

Osteoprogenitör hücreler ve fibrin matriksten kaynaklanan kıkırdak dokusu hücreleri prekondroblast, kondroblast, kondrosit ve hiperkondrosit evreleriyle çoğalıp olgunlaşırlar. Kondrositler kollajen II ve proteoglikanların hakim olduğu kıkırdak matriksi yaparlar. Böylece osteoblast ve kondrositler tarafından yapılan osteoid doku ve kıkırdak matriks bir sonraki faza mineralizasyon için hazırlanır(32)

Osteoblast haline gelen kanlanmanın yeterli olduğu bölgelerdeki hücreler ise trabekülleri oluştur. Böylece en dış tabakada kıkırdak dokunun üstünü örten periostun derin tabakasından çoğalan osteojenik hücreler, orta tabakada kıkırdak doku, daha derinde ise kemik trabekülleri bulunur. Zamanla her iki kırık parçası da ucunda oluşan yakalık tarzındaki kitle birleşerek, kırığa bütünlük sağlayan dış kallusu oluşturur. Dış kallusun devam eden gelişimi esas olarak kemik hücrelerinin çoğalmasına ve kıkırdak dokudaki(orta tabakada) interstisiyel büyümeye bağlıdır. Aynı şekilde ilik boşluğunda da aynı olaylar birbirini takip eder. Endost ve iliğin osteojenik hücresinden gelişen trabeküllerle, iliğin köprülenmesi oluşur ve iç kallus meydana gelir. İlk 7-12 günün sonrasında yumuşak kallus kitlesi, fibröz doku ve kıkırdaktan oluşmuştur ve kıkırdak sahasını çevreler(152)

Onarım evresinin ilk zamanlarında kıkırdak oluşumu(kıkırdak kallus) belirginleşir. Damar yenilenmesi, mevcut kan damarlarında tomurcuklanmayla olur ve kanla beslenme yeterli olursa osteoblastlar kallus içinde normal kemik gelişimine elverişli matriksi sağlamış olurlar. Hücre düzeyinde yapılan çalışmalara göre, damar endoteli sialik aside bağlı olarak, kıkırdak doku da proteoglikanlardan zengin olduğu için negatif yüklüdür. Yeni damarlanmayla kıkırdak doku arasındaki bu itme kuvveti nedeniyle, damarlanma engellenmektedir. Kalsiyum bu negatif yükü pozitife çevirerek, yeni damarların kıkırdak dokuya yönelimini sağlamaktadır. Dolayısıyla sert kallus(kemik kallus) dokusu gelişimi için damarlanma, bunun sağlanabilmesi içinse osteoidin mineralizasyonu gereklidir(125)

Mineralizasyonda ortak teori; osteoiddeki matriks vezikülleri varlığıdır. Bu veziküller, yüksek konsantrasyonda Ca ve XX0 , XXXX, ATP, adenozintrifosfataz, alkalen fosfataz, piro fosfataz, Ca bağlayan protein ve fosfoserin içerirler. Matriks vezikül membranı, Ca iyonlarını veziküle taşıyan çok sayıda Ca pompasına sahiptir. Vezikül içindeki iyon konsantrasyonu arttığında, kristalizasyon oluşur ve büyüyen kalsiyum hidroksiapatit kristal parçaları membranı delip matriks vezikülünü patlatarak içeriğini salar. Piro fosfataz enzimi, kalsifikasyonu önleyen piro fosfatları parçalar. Alkalen fosfataz ise fosfat esterlerinden fosfat iyonunu serbestleştirerek kalsiyumun çökmesini sağlar. Matriks veziküllerine salınan kalsiyum hidroksiapatit kristalleri kristalizasyon kaynağı olarak hareket eder. Kristalizasyonun çevresindeki iyonların yüksek konsantrasyonu, kalsifikasyon faktörlerinin varlığı ve kalsiyum bağlayan proteinler, matriks kalsifikasyonunu teşvik ederler. Alkalen fosfataz salgılanır. Kondrositlerden kıkırdak matriks vezikülleri de atılmaya başlar. Kıkırdak matriks kalsifiye olur. Kalsifiye doku içinde kalan kondrositler difüzyonla beslendiğinden ölür ve bulundukları yerde lakünalar meydana gelir. Kondroklastik faaliyette geri emilim artar ve lakünalar genişler. Bu süreç devam ederken, lakünar boşluklara kılcal damarlar ve kemik hücreleri girmeye başlarlar. Zira kalsifikasyon olmaksızın damarlanma ilerleyemez. Parçalanan kalsifiye kıkırdağın yerini almak için damarlı doku ve osteoblastlar gerekli mekanik uyarılarla kemik yapımına başlarlar.(84).

Nekrotik kırık uçları dolaşımdan yoksundur ve ortadan kaldırılması gerekir. Kırık iyileşmesinde gerekli olan bu fonksiyonun, nasıl başladığı kesin olarak bilinmemektedir fakat kırık bölgesinde önemli miktarda tespit edilen proteoglikanların yeri osteoklast oluşumuyla mevcut osteoklast aktivitesinde artışa neden olduğu düşünülür. Osteoklastlarla meydana gelen rezorbsiyon boşluklarını osteoblastlar sararak canlı kemik gelişmesini sağlarlar. Neticede nekrotik bölgenin tümü canlı kemikle yer değiştirir(159).

Kırık kemik uçları, iç ve dış kallus gelişimi ile çok sağlam bir yapıya kavuşur. Kallus oluşumu, yetişkinlerde çocuklardan ve kompakt kemikte trabeküler kemikten daha yavaş meydana gelmektedir. Yaralanmadan sonra kallus oluşması ve mineralizasyonu 4-16 hafta arasında zaman gerektirir. Kallus

oluşumuyla beraber kaynamanın oluştuğu söylenebilir. Bununla beraber, kaynama henüz son noktasına ulaşmış değildir, onarım evresinin ortasında, kallusun gereksiz ve etkisiz kısımlarının geri emilimi ve trabeküler kemiğin stres çizgileri boyunca uzanması ile yeniden şekillenme evresi başlar(142).

2.1.4.3 Yeniden şekillenme(remodeling)

Kemik tamiri ve hemostazı için gerekli olan tüm dinamik olaylar topluluğudur. Bu evre güçlü ama düzensiz sert kallusun, normal veya normale yakın güçteki daha düzenli lameller kemiğe dönüşümüdür. Onarım evresinin ortasında başlayıp normalde insanlarda 4-16 hafta sürerken, yıllar boyunca da devam eder(12).

Tüm bu reaksiyonlar aktivasyon-rezorpsiyon-formasyon olarak bilinir. Osteoblastlar sinyal faktörleri(PTH) ile aktive olurlar ve bir kemik bölgesini boşaltırlar; osteoklastlar stimule olurlar ve osteoblastların açığa çıkardığı alana tutunup rezorpsiyona başlarlar(13). Daha sonra da henüz tanımlanamamış bir sinyal ile rezorpsiyon durur ve tutunma yerlerinden ayrılırlar. Osteoklastik rezorpsiyon alanları(howship’s lakünleri) daha sonra osteoblastlar tarafından doldurulur ve daha sonra kalsifiye olup kemik oluşturacak osteoid salgılarlar(97).

Xxxxx kanunu günümüzde kemiğin yeniden şekillenmesinde de temel bir kural olarak kabul edilmektedir. Mekanik strese maruz kalan kemiğin konveks yüzü pozitif, konkav yüzü ise negatif elektrikle yüklendiğinden, osteoklastik aktivitenin hakim olduğu konveks yüzeyde geri emilim ve osteoblastik aktivitenin hakim olduğu konkav yüzeyde ise yeni kemik yapımı olmaktadır. Yani “kırığın konkav tarafında kemikleşme, konveks tarafında ise rezorpsiyon” olur. Bunun sonucu olarak da kemik kırık öncesi orjinal şeklini alır(72)

İnsanlarda aktivasyon-rezorpsiyon-formasyon prosesi 3-6 ay sürer ve bu süre sigma olarak bilinir. Sigma köpeklerde 3 ay, tavşanlarda ise sadece 6 haftadır (115).

2.1.5. Kemik İyileşmesini Etkileyen Faktörler

Kırık iyileşmesi fazları mediatör mekanizmaların kontrolü altındadır. Lokal ve sistemik olarak bilinen ve şu anda bilinmeyen faktörlerle bu mekanizmalar etkilenir, kırık iyileşmesi iyi veya kötü yönde kontrol edilir. Dokuların iyileşme süreci üzerine etki eden pek çok değişken vardır. Bunları lokal ve genel faktörler olarak iki xxx xxxxxx altında toplanır(11,14,21,31).

2.1.5.1. Lokal Faktörler

Travmanın şiddeti iyileşmeyi geciktirir. Kemik ve yumuşak doku kaybı olabilir. Bu da kırık iyileşmesi üzerine olumsuz etki yapar. Bunun nedeni artan nekrotik doku miktarının çok yönlü farklılaşma potansiyeline sahip mezenkimal hücre göçüne ve vasküler invazyona engel olmasıdır(11).

Kırık uçları birbirinden uzaksa, iyileşme güçleşir. Bunun nedeni de temelde, kanla beslenmenin bozulmasıdır. Kırık uçları arasındaki kallusun beslenmesi granülasyon dokusu ve kırık bölgesine gelen kan damarlarıyla olur. Bu dolaşımının bozulması kırık iyileşmesini birinci derecede bozan nedendir(14).

Spongiöz ve kortikal kemik kırıklarının iyileşmesi yüzey alan farklılıkları, hücresel zenginlik ve vaskülarite gibi nedenlerden dolayı farklılıklar gösterir. Karşılıklı gelen spongiöz kemik uçları kortikal kemiğe oranla daha süratle kaynar, çünkü kan ve hücreden zengindir ve birim alana düşen kemik temas yüzeyi daha fazladır. Kortikal kemikte ise birim temas yüzeyi daha az ve kanlanma daha zayıftır(131).

Genellikle enlemesine kırıklara göre kaymamış veya az kaymış spiral ve oblik kırıklarda iyileşme daha iyi olur. Spiral ve oblik kırıklarda her iki fragmanın daha eğri ve geniş olan kırık yüzeylerindeki damarlanma, kırık iyileşmesine yardım eder, enlemesine kırıkta damarlar aynı düzeyde kesilmiştir. Aynı nedenle, birbiriyle devamlılığı kalan parçalı kırıklarda, birçok parça olmasına karşın kırık iyileşmesi iyidir(14).

Kırık bölgesinde, cilt veya mukozanın da yaralanmasıyla oluşan açık kırıklarda kallus ve kırık iyileşmesi için osteoblastik faaliyetle yatak görevi yapacak olan kırık hematomu dışarıya boşalmıştır. Ayrıca dış ortamdan gelen bakteriler sonucu enfeksiyon gelişebilir, kırık iyileşmesi geç olur, bazen de hiç olmaz(45).

Kırık bölgesinde, yumuşak doku yaralanması meydana geldiğinde damarlarla beslenme bozulur ve yeni kemik dokusu gelişimi mezenkimal hücrelerden kaynaklanamaz. Ayrıca, kırık fragmanlarını yerinde tutacak olan yumuşak dokuların yaralanması kırık tespiti ve dolaylı olarak kırık iyileşmesini bozar(11).

Enfeksiyon, kırık yerindeki granülasyon ve kemikleşme dönemindeki dokuları harap eder, fibröz doku ve nedbe dokusu geliştirerek kırık iyileşmesini bozar(45).

Dejeneratif, metabolik, tümoral, enfeksiyon, veya radyoterapi gibi nedenlerle lokal direnci azalan kemikler ufak bir travma ile kırılabilir. Malign tümörler ve enfeksiyonlar varlığında, kırık bölgesinin kanserli veya iltihaplı hücrelerle dolu olması nedeniyle, sağlıklı bir biçimde kaynama olamaz. Dolayısıyla, bu gibi durumlarda altta yatan neden tedavi edilmeden sağlıklı bir kırık kaynaması elde edilemez. Tutulan kemiğin miktarı ve hastalığın agresifliğine bağlı olarak değişmekle birlikte malign olmayan lezyonlar ve Paget gibi hastalıklarda mezenkim hücrelerinin diferansiyasyon yetmezliğine bağlı olarak kapiller gelişim azlığı sebebiyle kırık iyileşmesi yavaşlar veya hiç olmaz. Osteoporozun ise kırık kaynaması üzerine olumsuz bir etkisi yoktur ancak temas eden yüzey miktarı düşük olduğundan, mekanik olarak kırık bölgesinin sağlamlaşması daha uzun zaman alır(71). Radyoterapi uygulanmış kemikler kolay kırılabildiği gibi iyileşme yavaştır veya hiç olmayabilir. Işınlama yapılan yerde hücre ölümü, damarlarda tromboz , kemik iliğinde fibrozis nedeniyle kemikleşme için gerekli yeni kapillerlerin ilerlemesi olanak dışıdır ve onarım gecikir(145).

Kırıkların gerektirdiği tespit şekline uyulmazsa kırık uçlar hareket ederek kırık bölgesindeki yeni damarlar parçalanır veya tıkanır, sonuçta kırık kemik onarımı bozulur. Redüksiyon ve manipulasyon denemelerinin tekrarlanması ve

zorlanması da kırık iyileşmesini geciktirir. Kırık uçları arasındaki damarlanma, granülasyon dokusunu ve yeni kemikleşme için ön koşul olan fibrinli yapıyı bozarak onarımı zorlaştırır. Değişik aralarla yapılan redüksiyon denemelerinin her tekrarlanışında yeni bir kanama ve aşırı bir kallus gelişimi olur ve iyileşme gecikir(130).

Lokal olarak uygulanan elektriksel yaklaşımlar tedaviye cevabı zayıf olan kırığın iyileşmesini stimüle edebilir. Elektrik alanları, hücre proliferasyonu ve sentez fonksiyonu hızlandırarak kırık iyileşmesi üzerine olumlu etki yaparlar(21).

Kırık bölgesinde herhangi bir sinirin zarar görmesi sonucu iyileşme bozulduğu bildirilmiştir(11).

Düşük kuvvette lazer uygulamasının hayvan deneylerinde morfolojik, biokimyasal, radyolojik ve ultrastrüktüel olarak kırık iyileşmesi üzerine hızlandırıcı etkisi olduğu gösterilmiştir(140).

Deneysel ve klinik araştırmalar düşük şiddette ses dalgalarının uzun kemiklerde kırık iyileşmesini hızlandırdığını göstermiştir. Bu olumlu etki taze kırıklarda olduğu kadar psödoartroz veya kaynama gecikmelerinde de gözlenmiştir. Ancak etki mekanizması tam olarak aydınlatılamamıştır(11).

Günde yaklaşık iki saat, 2-3 atmosfer basınç altında oksijen uygulanmasının kırık iyileşmesine yardım ettiği gözlenirken, günde altı saatlik dozda uygulamaların kırk iyileşmesini geciktirdiği izlenmiştir(143).

2,8 ATA basınç altındaki bir basınç odasında saf oksijen soluyan bir insanda oksijen basıncı normalin 1013 katına kadar çıkmakta, plazmada %6 volüm oksijen çözünmektedir. Kısaca plazma, dokulara hemoglobine gerek duymadan oksijen taşıyacak duruma gelmekte, venöz kanda bile hemoglobin süperrsatüre bulunmaktadır. Böylece hastanın fizyolojik veya patofizyolojik durumuna göre organlarda ve yapılarda şu etkiler oluşabilmektedir; lökositlerin fagositoz etkinliğinin artması, kapiller duvarlarına lökositlerin yapışmasının azalması, normal damarlarda vazokonstrüksiyon, fibroblastların çoğalmasının ve kollajen proliferasyonunun düzenlenmesi, adenozin trifosfatın hücre

membranında korunması ile doku ödeminin sekonder olarak azalması, bazı immun reaksiyonların suprese olması, kapiller proliferasyon(172).

İyi redükte ve tespit edilmiş kırık kemiklere erken fonksiyon ve kontrollü yük verilmesinin kemik gelişimini uyardığı bildirilmiştir. Bunun nedeni PGE2 miktarının artması ve dolaşıma olan etkisidir(11).

Saflaştırılmış ve kültür ortamında çoğaltılmış mezenkimal kök hücrelerin(MSC) in vivo implantasyonları sonucu ektopik osteokondrojenik potansiyelleri bildirilmiştir(41).

Ayrıca kriyoterapi sonrası bile MSC’lerin osteojenik potansiyelinin kaybolmaması MSC’leri kemik rejenerasyonu için oldukça uygun olduğunu gösterir(177).

2.1.5.2. Genel Faktörler

Hastanın yaşı kırık iyileşme hızını doğrudan etkiler. Çocuklarda, kemik onarımı için gerekli yeni damarlanma ve mezenkimal hücre farklılaşması çok hızlıdır. Yeni doğan ve süt çocuklarında iyileşme büyük çocuklara göre, büyük çocuklarda iyileşme erişkinlere göre daha hızlıdır(109).

Diyabet, anemi, tüberküloz, raşitizm gibi hastalıklar ve beslenme bozuklukları kırık iyileşmesini geciktirir. İltihabi olaylar (tüberküloz, kronik hastalıklar), hiperemi nedeniyle kalsiyum tuzlarının çözülmesini etkiler. Artan lökositlerin proteolitik enzimleri matriksin bozulmasına neden olur ve osteoid oluşumunu engeller. Dolaşım sistemi hastalıklarındaki hiperemi kemikleşmenin azalmasına ve osteoporoza neden olur(109).

Parathormonun, osteoklast sayısını arttırıcı, kemiğin yeniden şekillenmesini uyarıcı ve osteositleri uyararak osteolizi hızlandırıcı etkileri vardır. Paratiroid hormonun kemik üzerine net etkisi kemik rezorbsiyonunu arttırmak iken iskelet yapıya etkisi karışıktır. Paratroid hormon osteoklastik aktiviteyi zaten var olan osteoklastların aktivitesini arttırarak ve ayrıca yeni osteoklastların oluşmasını sağlayarak stimüle eder. Bu gelişmeler, paratroid

hormonun osteoklastlar üzerine direkt bir etkisi olmadan gerçekleşmektedir. İzole osteoklastlar üzerinde yapılan çalışmalarda, osteoklastların paratiroid hormona direkt yanıt vermedikleri veya üzerlerinde spesifik bir paratiroid hormon reseptörü bulunmadığı görülmüştür. Bu sinyali iletecek ayrı bir hücreye ihtiyaç vardır ve bu hücre osteoblasttır. Paratiroid hormon inaktif halde bekleyen yüzeydeki osteoblastlara da etkilidir. Bu hücrelerin retraksiyonuna ve böylelikle osteoklastların kemik yüzeyine ulaşmasına neden olurlar(97).

Kalsitonin, PTH’nın antogonistidir. Hem kompakt hem de trabeküler kemik yapımını arttırır. Kalsitonin dozu ve yeni kemik oluşumu arasında doğru orantı vardır. Farmakolojik dozlarda verildiğinde in vitro olarak osteoklastik aktiviteyi ve böylelikle normal ve anormal kemik rezorbsiyonunu engellediği belirtilmektedir(189). Bu etkiler kısa sürelidir ve gerçekten kemik turnover mekanizmasında önemli bir rol oynayıp oynamadığı bilinmemektedir.(94)

Diabetes mellitus varlığı kırık iyileşmesi için olumsuz bir faktördür. Hayvan deneylerinde diyabetin enkondral kemikleşme sırasında mezenkimal hücre proliferasyonunu inhibe ettiği ve kıkırdak oluşumunu geciktirdiği bildirilmiştir. İnsülinin kemikteki kollajen sentezi üzerindeki stimülan etkisi son derece önemlidir. Diyabetteki kırık iyileşmesinin gelişmesinde Tip X kollajen sentezinde bir azalmanın rol oynayabileceği hayvan deneylerinde gösterilmiştir(11).

Büyüme hormonu ve diğer anabolizan hormonlar, proteine bağlı kalsiyum artışını etkileyerek, kırık iyileşmesine yardımcı olur. Büyüme hormonu kallus hacminde artışa sebep olur(53). Kemik üzerine etkisi direkt (osteoblastlar üzerindeki reseptörlere etki ederek) veya indirekt (karaciğerden somatomedin salınımını arttırarak) yollardan olmaktadır(45).

Kortikosteroidler, mezenkimal hücrelerden osteoblast gelişimi ve matriks oluşumu için gerekli yapı taşlarının sentezini yavaşlatarak kırık iyileşmesini geciktirirler. Kallus oluşumunu azaltırlar ve bunun yanında somatomedin sentezini de inhibe ederler. FDGF, EGF ve PDGF üzerine antagonist etki yaparak kırık iyileşmesini olumsuz yönde etkilerler(25,86,120,164).

Gonodal steroidler, gelişim esnasında, ergenlikte ve daha sonrasında iskelet sisteminin bütünlüğünde etkilidirler. Menopoz döneminde görülen,

östrojenin azalması kemik rezorbsiyonu oranında bir artışa neden olur. Bu etkiler engellenebilir veya bir dereceye kadar östrojen uygulanmasıyla geri döndürülebilirler. Mekanizması tam olarak açıklanamamakla birlikte osteoklastlar üzerinde az miktar da olsa östrojen reseptörleri bulunmuş ve bu eylemde osteoblastların bir rolü olduğu düşünülmüştür. Yapılan çalışmalarda androjenlerin erişkin iskelet sistemi üzerine anabolik etkilerinin olduğu bulunmuştur(94).

Kalsitriolün esas görevi gastrointestinal sistemden kalsiyum geri emilimini arttırmaktır. Osteoblast aktivitesi kalsitriol tarafından direkt stimüle edilir. Etkisi osteoblastların bölünmesi ve diferansiasyonunadır(153).

A vitamini, normal dozda mezenkimal hücre farklılaşmasını uyararak kırık iyileşmesine yardım eder. Eksikliğinde osteoblast düzenlenmesinde ve osteoklast aktivitesinde bozulma olur ve kemik oluşumu engellenir. A vitamini fazlalığında ise hücre çoğalmasının olmamasıyla birlikte kıkırdak kolonlarında erozyon meydana gelir. Osteoklastlara farklılaşma uyarılır ve kırık iyileşmesi gecikir(11).

C vitamini, kollajen yapıya desteğinden ötürü kemik iyileşmesini olumlu etkiler(21).

İnsanda, kırık iyileşmesi sırasında kan 24,25-OH-vitamin D3 düzeyinin yükseldiği gözlenmiştir. Eksojen D3 vitaminin erişkin sağlam hayvan modelinde kırk iyileşmesi üzerine olumlu etkileri hem ultrastrüktüel hem de biomekanik olarak gösterilmiştir. D vitamini eksikliğinde kalsiyum düzeyi düşer ve kemik kalsifikasyonu zayıflar. Kalsiyumun kemikten kana geçişi yanında, kemik hücrelerinde sitrat üretimini arttırır. D vitamini normal dozda kemik iyileşmesini hızlandırırken, toksik dozda olumsuz etki eder(36).

B6 vitamini eksikliği ve K vitamini antogonistleri kırık iyileşmesini olumsuz etki ederler(36).

Antikoagülanlar kırık iyileşmesini, mekanik olarak pıhtı oluşumunu engelleyerek ya da bölgedeki hücre sayısını değiştirip aktivitelerini etkileyerek geciktirirler(14).

Nonsteroid antienflamatuarlar; prostoglandin inhibisyonu sonucunda lokal kan akımını yavaşlatarak veya primitif osteoblastların fonksiyonunu engelleyerek ossifikasyonu geciktirirler(78).

Antibiyotikler, hücresel ve matriks dejenerasyonunu azaltır, kollajen yapımını etkiler ve bunun sonucu olarak da bükme kuvvetlerine karşı dirençte azalma meydana getirir(78).

Deneysel çalışmalarda L-Dopa’nın büyüme hormonunu arttırarak kırık iyileşmesini olumlu etkilediği görülmüştür(139).

2.2. Kriyoterapi

Bir biyolojik sistemden ısının çekilerek doku hasarı meydana getirilmesi işlemine kriyoterapi denir. Kriyoterapi, Yunanca Cryos (buz gibi donmuş) ve therapy(tedavi) kelimelerinden oluşur(195). Kriyoterapide amaç hedeflenen dokuların soğutularak nekroze edilmesidir. Bu işlem, kriyojenik ajanların doku ile direkt veya indirekt olarak temas ettirilmesi suretiyle yapılır. Tıbbın birçok dalında geniş bir kullanım alanına sahiptir(113).

Mısırlılar M.Ö. 2500’te travma ağrısını dindirmek için soğuk ajanlar kullanmışlardır. M.Ö 5. yy’da Hipokrat, travma veya kemik hastalıklarından kaynaklanan ağrının giderilmesinde soğuk uygulamasının önemine değinmiştir. Hipokrat'tan sonra geçen yirmi yüzyıl içerisinde soğuk uygulaması sadece anestezik olarak kullanılmıştır(88).

Dr. Xxxxx Xxxxxx kontrollü doku yıkımında aşırı soğuk tatbikini uygulayan ilk hekim olmuştur. 1851 ağrı ve hemorajiyi lokal olarak kontrol etmek amacıyla -24°C’ye kadar soğutulmuş tuz-buz karışımı kullanmıştır(44,76).

Dr. Xxxxxxx Xxxxx 1889 yılında sıvılaştırılmış havayı lupus eritematozus, herpes zoster, verruka, nevi ve küçük hemanjiyomların tedavisinde kullanmıştır(76).

Irvive ve Turnacliffe karbondioksit karı bulunana kadar sıvılaştırılmış havayı sebaroik keratoz, liken ve dermatit ve herpes zoster tedavisinde başarıyla yıllarca uygulamışlardır(28).

Dr.Xxxxxxxxx 1942 yılında deri bir torba içinde toplanan ve çubuk şeklinde sıkıştırılarak kullanılabilen taşınabilir bir karbondioksit karı geliştirmiştir(28).

Bu ajanların tamamı sıvı nitrojenin kullanılmaya başladığı, yani bir anlamda modern kriyoterapinin başladığı tarih olan, 1960’lı yıllara kadar uygulanmıştır(44,76).

Xxxxxx S Xxxxxx ve Xxx 1961 yılında dokuları birkaç santimetre derinliğine kadar etkileyebilen bir kapalı sistem likit nitrojen (sıvı azot) cihazı geliştirdiklerini bildirmişlerdir(15,51,141,157).

Xxxxxxx Xxxxx 1965 yılında , Xxxxxx'xx geliştirdiği alete bir sprey sistemi eklemiş, 1967 yılında da Zacarian sistemi elde taşınabilir ve uygalanabilir boyutlara getirerek popülaritesini arttırmıştır(51,88).

1968 yılında Xxxxx X. Xxxxxxx 1968 yılında primer ve metastatik kemik tümörlerinin tedavisi için ortopedide kriyoterapiyi kullanmaya başlamıştır(76).

Bu gelişmeler sonunda daha derin doku tahribi oluşturmak mümkün olmuştur. Böylece benign lezyonlar yanında malign lezyonlar da kriyoterapinin kullanım alanına dahil olmuştur.

2.2.1. Kriyojen maddeler

Kriyoterapi, hücre içindeki ve dışındaki saf suyu buz kristalleri haline getirerek hücre ölümü yaratır(1,2,3). Bu amaç için kaynama derecesi çok düşük olan maddelere gereksinim vardır. Spesifik olarak düşük sıcaklık yaratmakta kullanılan maddelere kriyojen denilir(20,113). Kriyoterapide hedeflenen dokulara soğukluğun iletilmesinde kriyojen maddenin seçimi çok hassas bir konudur. Kullanılan kriyojenlerin çoğu sıvı fazdadır ve gaz faza geçerken sabit

bir soğuklukta kalarak buharlaşma yoluyla sıcaklık uzaklaştırırlar. Florokarbon spreyleri, katı karbondioksit, nitröz oksit, argon ve sıvı azot en çok kullanılan kriyojen maddelerdir(Tablo 2.1)(111).

Xxxxxxxxxxx

XX0

X0X

X0

Xx

Kaynama nok. -30-60 °C

-79°C

-89°C -196°C -186°C

Tablo 2.1: Kriyojen maddelerin kaynama dereceleri

Bunlardan florokarbon gazları, nitröz oksit ve katı karbondioksit çubukları, benign ve prekanseröz lezyonların tedavisinde yeterli soğutma sağlarken, sıvı azot ve argon malignitelerinin tedavisinde tek seçilecek kriyojenlerdir(48,55,60,192).

Florokarbonların avantajları arasında kolay elde edilebilmeleri ve taşınabilir olmaları yer alır. Yetersiz soğutma kapasiteleri, inhalasyon yapıldığında toksik olmaları ve ozon tabakasına olumsuz etkileri nedeniyle artık kullanılmamaktadırlar(111).

Karbon dioksit kolaylıkla bulunabilir ve -79° C’lere kadar soğutma sağlayabilir(152)

Nitröz oksit yüksek basınçlı silindirlerde oda sıcaklığında sıvı halde saklanabilen kolay bulunabilen ve ucuz bir kriyojendir. Termal izolasyon gerektirmeyen metal veya plastik bir kılıf ile sarılı kapiller tüpler vasıtası ile - 89° C’lere kadar soğutma sağlayabilir. Sıvı nitrojenin temin edilemediği yerlerde, nitröz oksit apereyleri kullanılabilir. Nitröz oksidin çok uzun süre bozulmadan saklanabilmesi avantajına karşın toksik olması, hava ile temasında kristalizasyon meydana gelmesi ve kaynama noktasının -89° C derece olması nedeniyle malign lezyonların tedavisinde kullanılamayışı dezavantajlarıdır(60)

Son yıllarda argon gazıda kriyoterapide kullanılmakta ve -186° C’lere kadar soğutma sağlamaktadır(92).

Sıvı nitrojen günümüzde en sık kullanılan, kolay bulunabilen ve ucuz bir kriyojenik ajandır. -196°C’lere kadar soğutma sağlamaktadır. Dezavantajları

arasında vakumlu izole bir kapta saklanmasının gerekliliği ve prob kullanıldığı taktirde diğer ajanlara oranla daha yavaş bir soğutma sağlamasıdır(112,113).

Kriyojen maddenin dokuda hasar meydana getirebilmesi şu faktörlere bağlıdır(17,29,88):

l. Kriyojen maddenin kaynama noktası

2. Kullanılan probun yüzeyi veya spreyin ağız açıklığı

3. Dondurulacak doku veya tümörün derinliği, hacmi

4. Dokunun ısı iletkenliği

5. Doku veya tümörün hücresel ve stromal yapısı

6. Dokunun vaskülarite ve perfüzyon oranı

7. Dondurma hızı

2.2.2. Kriyoterapide kullanılan aletler

Kriyoterapi uygulaması için bir kriyojen madde ve bu maddenin dokuya iletilmesini sağlayacak bir düzeneğe ihtiyaç vardır. Bu düzenekler açık ve kapalı sistem olarak iki prensibe dayanır(20,113).

Açık sistem genellikle bir pamuk veya baget yardımı ile veya da sprey veya huni ile kriyojen maddenin dokulara iletilmesi prensibine dayanır(111).

Pratikte, kriyojen maddeleri en basit uygulama yöntemi "pamuk uçlu aplikatör"dür. Bu yöntemde, bir çubuğun ucuna sarılan pamuk, termos içinde saklanan sıvı azot içine batırılır ve lezyon üzerine uygulanır. Özellikle dermatolojide verruka, soler keratoz,liken planus ve seboreik keratoz gibi bir çok yüzeyel deri lezyonlarda kullanılabilir. Günümüzde bunu yapan modern aletler kullanılmaktadır(48,66,73)(Şekil 2.2).

Şekil 2.2. Modern kriyoterapi cihazı ve uygulama ucu

Ayrıca ortopedide geniş lezyonlarsa sıvı nitrojen bir huni yardımı ile patolojik dokuya açık teknik ile uygulanabilir. Ama uygulama esnasında oldukça tehlike sonuçlar doğurduğu ve komplikasyon olasılığı çok fazla olduğu için günümüzde kabul edilir bir yöntem olmaktan uzaklaşmıştır.

Kapalı teknik üç farklı prensibe göre çalışabilir(7,88);

1. Termo elektrik sistem; boyut olarak büyüktürler ve oldukça verimsizdirler.

2. Evaporatif sistem; kriyojen maddelerin kontrollü buharlaştırılmasıdır.

3. Joule-thomson etkisi; ince bir borunun içinden basınçlı gaz dolaştırılmasıdır.

Bu teknikte kriyojen maddenin dokulara daha düzenli ve kontrollü iletilmesini sağlamak amacıyla sprey uçları ve problar kullanılır. Sprey, genellikle yüzeyi düzensiz, çapları 0,5-1 cm'den büyük olan lezyonlarda kullanılır. Özelliği yüzeysel bir donma sağlaması ve dondurucunun spreyin başlığından hedef bölgeye doğrudan uygulanmasıdır(111). Lezyonun çapına uyacak bir dağılım salıyacak sprey başlığı seçilir. Sprey lezyonun ortasına hedeflenir. Sprey başlığı hedeften ortalama 1 cm. uzakta tutulmalıdır. Uygulama esnasında önemli olan çevredeki sağlam dokuların korunmasıdır. Uygulama gerekli görüldüğü sürece devam ettirilir. Burada klinisyenin tecrübesi önemlidir (88). İkinci bir donma halkası oluşrulacaksa bunu çözülmenin hemen ardından uygulamak gerekir. Bu durum genellikle

maligniteler için geçerlidir. İyi huylu tümörler veya prekanseröz oluşumlar için çoğu kez tek donma halkası yeterlidir(187).

Xxxx xxxxx metodunun lateral yayılımını önlemek, kriyojenin sadece lezyon üzerine uygulanmasını sağlamak ve çok küçük lezyonları da sprey metodu ile tedavi edebilmek için "kapalı sprey(cone sprey)" yöntemi gelişti- rilmiştir. Bu yöntemde,alt uçları değişik boyutlarda kesilmiş neopren koniler veya otoskop konileri kullanılır(111,150,151)(Şekil 2.3)

Şekil 2.3: Farklı tipte sprey uygulama uçları

Prob tekniğini geliştiren Zacarian'dır. Yüzeyi düzenli lezyonlarda uygulanır. Spreye kıyasla dondurma hızı daha yavaş bir tekniktir Elde edilen soğukluk dereceleride spreye oranla daha azdır(195,192).

Özellikle mukozalarda veya yaş yüzeylerde yerleşen tümörlerde probu önceden soğutmak gerekir. Böylece ucun lezyona yapışması önlenir. Lezyona uyan tip ve boyutta prob seçilir. Prob hedef dokuya sıkıca bastırılır. Basıncın arttırıldığı ölçüde donma derinleşir. İşlemin yeterli olup olmadığına donma halkasının boyutuna bakılarak karar verilir. Prob çözüldükten sonra uygulama yüzeyinden uzaklaştırılır. Gerekirse aynı işlem tekrarlanır(88,150). Özellikle probun lezyon yüzeyi ile tam olarak temas etmediği durumlarda kavite soğuğu yetri kadar iletilme potansiyeli olna bir madde ile tamamen doldurulur ve bu ara madde soğutularak lezyonun tamamının eşit ve kontrollü olarak soğutulması sağlanır(151).

Basit bir termos içerisinde sıvı azotun saklanma süresi ancak 6-8 saattir. Sıvı azotu daha uzun süreler saklayabilmek için vakumla yalıtılmış 15-25 litre kapasiteli tanklar kullanılır. Stabil olmayan sıvı azot, bu tanklarda,60-90 gün korunabilir ve gerektiği zaman daha küçük kapasiteli cihazlara aktarılabilir(111)(Şekil 2.4)

Şekil 2.4: Sıvı nitrojen tankları

Taşınabilir sıvı azot sprey üniteleri (handheld unit) basit, etkili ve standardize olmaları yanı sıra, benign ve malign tümörleri tedavi edebilme yeteneklerinden dolayı muayenehanelerde kullanım için uygundur.Bunların hem sprey hem de prob uç takılabilenleri tercih edilmelidir. Hastahaneler için, üzerine monitörizasyon cihazları monte edilmiş daha büyük aletler imal edilmiştir . Daha çok malign tümör tedavisinde kullanılırlar. Bu aletlerin neredeyse tamamı günümüzde joule-xxxxxxxx etkisi prensibiyle çalışmaktadır(55).

2.2.3. Kriyoterapide monitorizasyon

Kriyoterapinin uygulanması esnasınıda , ulaşılan sıcaklık derecesini ölçmek, dokuda yaratılan hasarın derinlik ve yaygınlığını saptayabilmek ve gerekli görüldüğü taktirde işlemi tekrarlamak amacıyla çeşitli yöntemler kullanılmıştır(141,181). Thermocouple (TC = soğuğa hassas hipodermik iğne) - Pirometre (soğukluk ölçen alet) monitörizasyon sistemi, bilgisayarlı tomografi, manyetik rezonans görüntüleme ve ultrason bunlardan birkaçıdır(111).

Dondurma süresi, tümörün genişliği ve derinliğine göre değişir.

Dondurma süresini belirleyen yöntemler şunlardır:

l. Torre metodu : Deney hayvanları üzerinde yapılan araştırmalarla saptanmış, klinik ve ampirik bir metod olan Torre metodu, buz küresinin lateral yayılımı ile ilgilidir .Örneğin, sprey metodunda 60-90 sn içerisinde kenarlarda 5 mm donuk halkası oluşturmakla yaklaşık 3mm derinlikte lethal sınır elde edilir . Fakat otörler arasında dondurma süresine ilişkin ortak bir kanı yoktur(158).

2. Thermocouple (TC)- Pirometre Sistemi: Sistem, iğne şeklinde TC ile 0° C derecenin altındaki sıcaklıkları ölçebilen pirometreden ibarettir. TC’ler, uygulamasından önce dondurulması hedeflenen dokunun 7-10 mm etrafına dairesel olarak yerleştirir. Tedavi başladıktan sonra TC’lerin ölçtüğü sıcaklık pirometreden okunur ve uygulama istenilen derecede kesilir.(88) (Şekil 2.5).

Şekil2.5: TC-Pirometre sistemi

3. Doku direnci ölçümü: Kriyoterapi uygulanan dokuda, su ve elektrolitler tecrit edildiğinden dolayı, doku, elektrik akımını iletme özelliğini yitirir. Rezistans ölçen bir ohmmetre yardımıyla, elektrik akımının ölçülemediği nokta lethal nokta olarak belirlen. İki elektrod tümörün ortasına ve kenarına 5 mm batırılır. İki elektrod arasındaki direncin bir megaohm olması -25-(-3O)º C ye , beş megaohm olması -60°C dereceye eşittir(88) .

2.2.4. Kriyobiyoloji

Kriyoterapi uygulamasında ortaya çıkan biyolojik değişiklikler dokunun donmasına bağlıdır. Isı transferinin hızı, doku ile çevre arasındaki sıcaklık farkının bir fonksiyonudur. Kriyoterapi sırasında, çok düşük sıcaklıklar kullanıldığı için, hızlı bir ısı akışı ortaya çıkar. Baget ve xxxx xxxxx gibi, sıvı nitrojenin lezyona direkt olarak temas ettiği teknikler kullanıldığında, kaynama ısısı transferi olur. Soğutulmuş bir metal probun lezyona temas ettiği kapalı tekniklerde ise iletim tipi ısı transferi olur(5). Prob, ısı transferine karşı bir direnç oluşturduğu için, bu tip ısı transferi daha yavaştır(20).

Dokunun dondurulması ile oluşan hasarın iki mekanizması vardır(51,67,91):

• Hücreler üzerine direkt etki

• Dondurma işleminden sonra gelişen indirekt etkiler Vasküler etkiler

İmmünolojik etkiler

Sıcaklığın düşmesiyle birlikte hücrenin fonsiyonlarında ve yapısında özellikle yağ ve protein komplekslerinde ciddi değişiklikler görülür. Isı düşmeye devam ederse metabolizma yıkıma uğrar. Eğer bu düşme devam ederse hücre ölümü kaçınılmaz olur.

Dondurma esnasında dokuda oluşan esas değişiklik intraselüler ve ekstraselüler suyun buz haline gelmesidir. Yavaş soğutma ekstraselüler buz oluşumuna neden olur (4,136). Ama amaç hücre içi hasar yaratmaktır. Bu nedenle soğuğun hızla düşürülmesi ve hücre içi suyun kristalize olması amaçlanır. Böylelikle hiperozmotik bir hücre dışı alan yaratılmış olur. Bu da suyun hücre dışına çıkmasına yol açar.. Dondurma işleminin dolaşım üzerine etkisi de hasarın artmasına katkıda bulunur. Meydana gelen vazokonstrüksiyon, kan akımında azalma ve vasküler hücrelerin kesin olarak

tahrip olmasını sağlar(106). Tekrarlayan dondurma-çözünme siklusları ile maksimum tahrip edici etki elde edilir(48,79,157,186).

Son yıllarda üzerinde en çok durulan konulardan biri "kriyoimmünoloji"dir. Bilindiği gibi kriyoterapinin etkisi, tümörü "in-situ" parçalayarak yok etmektir. Hücrenin parçalanması sonucunda, hücre içinde kalmış tümör antijenleri ortaya çıkmaktadır. H-Timidin ve radyoaktif karbon ile yapılan bir çalışmada, kriyoterapi yapılan doku kitlesinin 72 saat süreyle kan dolaşımı bağlantılı olduğu gösterilmiştir(111). Özellikle, antitümöral hücresel immün yanıtın, bu süre içerisinde maksimal etkinliğe ulaştığı sanılmaktadır(77)

.

Xxxxx ölümüne muhtemel patogenez şöyledir(29,91,135):

1. Ekstrasellüler (hücre dışı) buz oluşumu

2. İntrasellüler (hücre içi) buz oluşumu

3. Hücre içindeki elektrolitlerin anormal konsantrasyonu.

4. Elektrolitlerin kristalleşmesi

5. Hücrenin büzüşmesi ve piknotik değişmelere yol açan hücresel dehidratasyon

6. Hücre membranının yırtılması

7. Isı şoku

8. Lipo-protein kompleksinin orijinal yapısının bozulması

9. İskemi oluşması

Kriyoterapinin ilk uygulanmasında meydana gelen buz kristallerinin mekanik olarak hücre ölümüne yol açtığı düşünülmektedir. In-vitro çalışmalarda, ilk olarak ekstraselüler buz kristallerinin oluştuğu ve kristallerin hücreleri sıkıştırdığı gözlenmiş fakat hücre membranlarının bu yolla yırtıldığını göstermek mümkün olamamıştır. Ekstraselüler donmanın tek başına hücre hasarını gerçekleştiremeyeceği açıktır. Çünkü, pratik uygulamada dondurma proçesinin çok hızlı olması nedeniyle intra ve ekstraselüler kristalizasyon çok

az zaman farkı ile oluşur(1). Ekstraselüler buz kristalizasyonu sonrasında, ekstraselüler suda azalma, buna bağlı olarak ozmotik farklılık, hücre içindeki elektrolitlerin hızla hücre dışına çıkmasına neden olur. Bunun sonucunda da oluşmakta olan ekstrasellüler buz kristalleri daha da büyür. Hücre küçülür, hücre mebranı ve içeriği hasara uğrar. Yeterli zaman verildiği taktirde artmış olan elektrolit konsantrasyonu hücrenin ölümü için yeterli olacaktır(2).

Ekstraselüler buz kristalizasyonu ve duyarlanma hasarı ancak yavaş dondurma yapıldığı zaman gerçekleşir.Oysa kriyoterapi işlemi hızlı dondurma prensibine dayanır ki hızlı dondurmada intraselüler buz kristallerinin oluşumu diğer olaylarla simültane sayılabilecek çabukluktadır. Donma hızı süratli oldu- ğunda, -80°C nin üzerinde intrasellüler buz kristalleri oluşur, intrasellüler mekanizmanın bozulması sonucu hücre harabiyeti meydana gelir. Hücre içi buz kristallerinin oluşması ile mitokondrium ve endoplazmik retikulum gibi hücre içi organelleri hasar görür. Oluşan buz kristallerinin boyutları da hasarın büyüklüğünde önem taşır. Özellikle hücre içi kristallerin hücre yaşamı için daha zararlı olduğu kabul edilir(1,2,3,4,136).

Özellikle erime sırasında buz kristalleri daha büyük kristaller oluşturmak üzre birleşirler. Bu olaya ikinci kristalizasyon denir. Bu da hücre membranları için yıkıcı bir ortam hazırlar. Ayrıca buz erirken ekstrasellüler ortam hipotonik olur ki su hasar görmüş olan dokuya girer, hücre hacminin artmasına ve hücre membranının yırtılmasına neden olur(1,2).

Hücre duvarındaki fosfolipidlerin, ısınma fazında "duyarlanma" nedeniyle parçalandığı öne sürülmekteyse de kanıtlanamamıştır. Canlı hücrelerin değişmez bir komponenti olan lipid-protein kompleksinin atomik bağları zayıftır, bu nedenle termal değişiklikler, özellikle de soğutma sırasında oluşan fizik değişikliklerle kolayca ayrılır(88).

Donma küçük damarlarda endotelyal hasarlara neden olur. Bu hasar kapiller duvarlarında artmış geçirgenliğe, ödeme, trombosit agregasyonuna, mikrotrombus oluşumuna ve sonuçta dolaşımda durmaya neden olur.Bir çok küçük damar 4 saat kadar sonra tamamen staza uğrarken, daha büyük damarlardaki stazlar 24 saat kadar sonra görülebilir. Kan kaynağının kesilmesi hücrelerin olası yaşama şanslarını tamamen ortadan kaldırır ve uniform bir

ölüme yol açar. Ayrıca kriyoterapi sonucunda bir immunolojik reaksiyonun gerçekleştiği, bu yüzdende malign hastalıkların tedavisinde önemli bir yeri olduğuna dair görüşler vardır(111).

2.2.5. Kriyoterapinin avantajları

Kriyoterapinin avantajları; hospitalizasyon gerektirmeyen, düşük riskli bir metod olması, yüzeysel deri lezyonlarında genel anestezi gerektirmemesi , zaman kaybettirmeyen hızlı bir metod olması, bir seansta birden fazla tümör tedavi edilebilmesi, postoperatif kanamanın yok denecek kadar az olması, komplikasyon riski oldukça az olması, deri lezyonlarında kozmetik sonuçlar genellikle çok iyi olması, maliyetinin az olması, dondurulmuş dokulardan biyopsinin kolaylıkla alınabilmesi ve özellikle deri lezyonlarında nadiren lokal anestezi gerektirmesidir(49,88).

2.2.6. Kriyoterapi kontraendikasyonları

Kriyoterapi için kesin bir kontrendikasyon yoksa da belirtilen durumlarda kriyoterapi yapılmaması önerilmektedir(49,50).

1.Agammaglobulinemi

2 .Bilinmeyen orijinli kan diskrazileri 3.Soğuk intoleransı

4.Soğuk ürtikeri

5.Kollojen ve otoimmün hastalıklar 6.İmmünosupresif ilaç kullanan hastalar 7.Böbrek diyalizine giren hastalar

8.Trombositopeniler ve trombosit fonksiyon bozuklukları 9..Xxxxxxx hastalığı

2.2.7. Kriyoterapinin komplikasyonları

Her tedavi yönteminde olduğu gibi kriyoterapininde bir takım komplikasyonları vardır. Spesifik komplikasyonlar uygulanan yönteme, uygulama süresine, lezyonun büyüklüğü ve lokalizasyonuna göre değişiklik gösterir(38,49,50,90).

1. Ağrı

2. Venöz gaz embolisi

3. İntradermal hemoraji

4. Ödem

5. Postoperatif enfeksiyon

6. Sistemik febril reaksiyon

7. Hemoraji

8. Hiperpigmentasyon

9. Hipertrofik skar

10. Nöropati (His kaybı)

11. Kemik nekrozu ve sökestr

3. GEREÇ VE YÖNTEM

3.1. Gereç

Çalışmamızda:

• 240±20 gr ağırlığında 13 haftalik erkek 126 adet Wistar-Albino sıçan

• Ketanest® flakon (Ketamin HCl, Parke Xxxxx,Almanya)

• Rompun® flakon (Xylazin hidroklorid, Bayer Türk Kimya Sanayi Limited Şirketi, Türkiye)

• Ameliyat seti

• Tur motoru ve piyasemen

• 3 mm çapında yuvarlak uçlu paslanmaz çelik frez

• İnsülin enjektörü

• Formaldehit çözeltisi(%10 )

• 3-0 yarım yuvarlak (.) 20 mm xxxx xxxxx ipliği(Doğsan Tibbi Malzeme Sanayi A.Ş., Türkiye)

kullanılmıştır.

3.2. Yöntem

3.2.1. Deney hayvanları ve grupları

Çalışmamızda deney hayvanlarının ameliyatlarını İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Deney Hayvanları Üretim ve Araştırma Laboratuvarında , kemik dokularının histopatolojik incelemelerini İstanbul Üniversitesi. Onkoloji Enstitüsü Tümör Patolojisi ve Onkolojik Sitoloji Anabilim Dalı`nda gerçekleştirdik.

Çalışmamızda 126 adet Wistar Albino cinsi 240±20 g ağırlığında 13 haftalık erkek denek, deney süresi boyunca 21±1 C sıcaklıkta, bağıl nem oranı

%40-60, ışık periyodu 12 saat aydınlık 12 saat karanlık standardını sağlayacak şekilde otomatize edilmiş olan ortamda, metal kafesler içerisinde muhafaza edilmişlerdir. Denekler normal su (çeşme suyu) ve İstanbul Yem Sanayii tarafından hazırlanan yemlerle beslenmiştir(Tablo 3.1).

Ham protein	En az	% 24
Ham selüloz	En az	% 7
HCl’de çözülmeyen kül	En çok	% 2
Kalsiyum	En az-en çok	% 1- % 2.8
Fosfor	En az	% 0.9
Sodyum	En az	% 0.5- % 0.7
Sodyum klorür	En çok	% 1
Lizin		% 1
Metiyonin	En az	% 0.6
Enerji	2650 kcal/kg

Tablo 3.1; Katı yem içeriği

Çalışmamızda kullanılan tüm deneklerin sağ ve sol tibiaları ve kontrol grubu deneklerinin sağ tibiaları deney protokolüne dahil edilmiştir. Araştırmamız 2 ana grup ve 3., 7., 14., 21., 28., 45. ve 60. günlerde sakrifikasyon dönemlerine göre düzenlenmiş 7 alt grup içermektedir.

Belirlenen ana ve alt gruplar aşağıdaki gibidir;

Ana gruplar

• 1. grup; Sağ ve sol tibialarına kemik defekti açılıp sol tibial defekte sıvı nitrojen, sağ tibial defekte karbondioksit gazı uygulanan grup

• 2. grup; Sağ tibialarında kemik defekti açılıp sağ tibial defekti kontrol olarak izlenen grup.

Alt gruplar :

1.Grup

63 denekten oluşan bu grupta, deneklerin sağ ve sol tibialarına kemik defekti açılıp sol tibial defekte sıvı nitrojen, sağ tibial defekte karbondioksit gazı uygulanmıştır. Sakrifikasyon günlerine göre 7 alt gruba ayrılmıştır;

a. Kemik defekti yapıldıktan sonra 3. günde sakrifiye edilen denekler

b. Kemik defekti yapıldıktan sonra 7. günde sakrifiye edilen denekler

c. Kemik defekti yapıldıktan sonra 14. günde sakrifiye edilen denekler

d. Kemik defekti yapıldıktan sonra 21. günde sakrifiye edilen denekler

e. Kemik defekti yapıldıktan sonra 28. günde sakrifiye edilen denekler

f. Kemik defekti yapıldıktan sonra 45. günde sakrifiye edilen denekler

g. Kemik defekti yapıldıktan sonra 60.günde sakrifiye edilen denekler

2.Grup

63 denekten oluşan bu grupta, deneklerin sağ tibialarına kemik defekti açılıp doğal iyileşmeye bırakılmıştır. Sakrifikasyon günlerine göre 7 alt gruba ayrılmıştır.

a. Kemik defekti yapıldıktan sonra 3. günde sakrifiye edilen denekler

b. Kemik defekti yapıldıktan sonra 7. günde sakrifiye edilen denekler

c. Kemik defekti yapıldıktan sonra 14. günde sakrifiye edilen denekler

d. Kemik defekti yapıldıktan sonra 21. günde sakrifiye edilen denekler

e. Kemik defekti yapıldıktan sonra 28. günde sakrifiye edilen denekler

f. Kemik defekti yapıldıktan sonra 45. günde sakrifiye edilen denekler

g. Kemik defekti yapıldıktan sonra 60.günde sakrifiye edilen denekler

3.2.2. Cerrahi uygulamalar

Deneklere, 5 mg / kg Xylazin hidroklorid ve 6 mg / kg Ketamin HCL karışımının periton içine enjeksiyonu ile genel anestezi uygulanmıştır. Standart postürde sabitlenen deneklerin sağ ve sol arka bacaklarının medial yüzeyleri temizlenerek cerrahi saha povidon iyot çözeltisi ile silinmiştir(Şekil 3.1).

Şekil 3.1: Deneklerde cerrahi için hazırlanmış alan

Sağ ve sol bacaklar fleksiyon pozisyonuna getirilerek tibiaların medial yüzeylerine ulaşmak amacıyla 20-25 mm unluğunda longitudinal yönde cilt, cilt altı ve periost kesisi yapılmıştır. Künt diseksiyonla tibiaların medial yüzeyleri açığa çıkarılıp yumuşak dokular ekarte edilmiştir(Şekil 3.2).

Şekil 3.2: Tibianın medial yüzeyinin açığa çıkarılması

Tur motoruna bağlı piyasemene takılan 3 mm çapındaki yuvarlak uçlu paslanmaz çelik frezle, steril serum fizyolojik çözeltisi irrigasyonu altında 5 mm uzunluğunda 3 mm genişliğinde, kemiğin korteks ve medulla tabakalarını içine alan kemik defektleri oluşturulmuştur(Şekil 3.3).

Şekil 3.3: Serum irrigasyonu altında kemik defekti açılması

Kriyoterapi uygulamaları(Şekil 3.4 ve 3.5) tamamlandıktan sonra defekt çevresindeki yumuşak dokular serbestlenip ameliyat sahası ipek dikişlerle, dikiş araları eşit olacak biçimde kapatılmıştır(Şekil 3.6). Denekler kontrol edilip yara bakımı yapıldıktan sonra kafeslere yerleştirilmiştir.

Şekil 3.4: Defekt bölgesine sıvı nitrojen uygulaması

Şekil 3.5: Defekt bölgesine karbondioksit gazı uygulaması

Şekil 3.6: Defekt bölgesinin kapatılması

3.2.3. Kriyoterapi uygulamaları

Soğutma için defekt bölgesine sıvı nitrojen kullanan açık sistem esasına dayanan Cry-ac(Brymill, USA)(Şekil 3.7) ve karbondioksit gazı kullanan MC-106(Bimed,TÜRKİYE) isimli cihazı uyguladık(Şekil 3.8). Tedavi protokolü her biri 1 dakika süren soğutma prosedürünün ardından kendi kendine erime periyodunu takip eden 1 dakikalık ikinci bir soğutma-erime döngüsüdür.

Şekil 3.7: Cry-Ac sıvı nitrojen spreyi ve ucu(Brymill, USA)

Şekil 3.8: MC-106 kriyoterapi cihazı ve ucu(Bimed, ANKARA)

Cry-ac(Brymill, USA) cihazı elektriğe bağımlı olmayan elle manipüle edilebilen, çift cidarlı, emniyet valfi sayesinde içeride oluşan basınç hemen tahliye edilebilen ve açık sistem prensibi ile çalışan bir el ünitidir.. Sıvı nitrojeni yaklaşık 20 saat statik olarak bozulmadan tutabilme kapasitesine sahiptir.

MC-106(Bimed,TÜRKİYE) dijital termal otokontrollü kriyo cihazı 220 volt şehir cereyanı ile çalışmaktadır. Sistem, hekimin çalışmak istediği derecelerin ayarlanabileceği bir gösterge paneline sahiptir. Sisteme yüklenmek istenen derece girilir ve ayak pedalına basılı tutulduğu sürece istenen derecelere otomatik olarak iner ve hafızaya yüklenilmiş olan derecede otomatik olarak durur. Xxxxxxxx -0xX sapma ile çalışmaya devam eder ve ayak pedalı bırakıldığında termal sistem devreye girer. Probun defrost işlemi başlar. Kriyo cihazı minumum 750 PSI CO2 gazı ile çalışır. CO2 tüpü ile cihaz arasındaki gaz taşıycı hortum bükülebilir, esnek, anahtar kullanmadan cihaz ve regülatör üzerine vidalı bir sistem ile kolaylıkla bağlanabilmektedir. CO2 gazını tüpten cihaza aktarmak için yüksek basınç regülatörü kullanılmıştır.

3.2.4.Işık mikoskopu takibi ve değerlendirme kriterleri

Yüksek dozda dietil eter anestezisinin irreversibl dönemdeki letal etkisi görüldükten sonra tüm deney ve kontrol gruplarının sakrifikasyon işlemleri tamamlandı. Sakrifikasyonun ardından sıçanların arka bacaklarında ameliyat bölgelerinin bulunduğu kısımlar çıkartıldı. %10’ luk formol çözeltisine alınan parçalar daha sonra yumuşak dokulardan temizlenerek defekt sahaları açığa çıkartıldı. Kemikler formik asit-sodyum nitrat çözeltisine yerleştirildi ve 11-14 gün beklenerek dekalsifiye edildi. Dekalsifikasyon süresince üç günde bir çözeltiler yenilendi. Daha sonra defekt sahalarını içine alacak biçimde kesilerek biçimlendirilen parçalar rutin takip yöntemleri ile işlem gördükten sonra enine kesit alınabilecek şekilde parafin bloklara gömüldü. Parafin bloklardan 0-0 x kalınlığında seri kesitler alınarak lam üzerine yerleştirildi ve 70◦C sıcaklıktaki etüvde deparafinize edildi. Daha sonra hematoksilen eosin(H&E) boyası ile boyandı ve ışık mikroskopunda farklı büyütmelerde incelendi.

Bütün gruplardan 3., 7., 14., 21., 28., 45., ve 60. günlerde elde edilen kesitler aşağıdaki değerlendirme kriterlerine göre sınıflandı;

• İltihap

• Fibröz doku oluşumu

• Nekroz

• Yeni kemik yapımı

Trabeküler kemik : Yeni kemik yapımı alanları

%0 - %5 arası alanı kaplıyorsa (0)

%5 – %30 arası alanı kaplıyorsa (1),

%30 – %60 arası alanı kaplıyorsa (2)

%60’tan fazla alanı kaplıyorsa (3) olarak değerlendirildi.

İltihap

%0 - %5 arası alanı kaplıyorsa (0)

%5 – %30 alanda ise (1),

%30– %60 arasında ve 1-2 mikro abse odağı içeriyorsa (2),

%60’in üzerinde / çok sayıda mikro abse odakları içeriyorsa(3) olarak değerlendirildi.

Nekroz

%0 - %5 arası alanı kaplıyorsa (0)

%5 – %30 arası (1),

%30 – %60 arası (2),

%60’tan fazla ise (3) olarak değerlendirildi.

Fibrozis

%0 - %5 arası alanı kaplıyorsa (0)

%5 – %30 arası (1),

%30 – %60 arası (2)

%60’tan fazla ise (3) olarak değerlendirildi.

3.2.5. İstatistiksel değerlendirme yöntemleri

Bu çalışmada istatistiksel analizler GraphPad V.3 paket programı ile yapılmıştır. Nitel verilerin karşılaştırmalarında ki-kare ve Xxxxxx gerçeklik testi kullanılmıştır. Sonuçlar, anlamlılık p<0,05 düzeyinde değerlendirilmiştir.

4. BULGULAR

4.1. Işık mikroskobu değerlendirmeleri

4.1.1 Kontrol grupları

4.1.1.1. 3 günlük kontrol grubu

Defekt bölghesinde taze kanama alanları arasında damardan zengin, gevşek yapıda bağ dokusu izlendi. Bağ dokusu içinde lenfosit, plazmosit ve nötrofil polimorf infiltrasyonu saptandı. Çevrede nekrotik kemik parçacıkları görüldü.

4.1.1.2. 7 günlük kontrol grubu

Defekt bölgesinde hücreden ve damardan zengin doku içinde ortalama

%40’a varan alanlarda yeni kemik trabekülleri saptandı. Çevrede küçük nekrotik artıklar ve hafif lenfoplazmositer hücre infiltrasyonu görüldü(Şekil 4.1).

Şekil 4.1: Defekt bölgesinde damardan zengin bağ dokusu içinde yeni kemik yapımı görülmektedir. (H&EX100).

4.1.1.3. 14 günlük kontrol grubu

Defekt bölgesini dolduran granülasyon dokusu içinde % 50- 60’a varan alanlarda yeni kemik yapımı ve hafif mononükleer iltihabi hücre infiltrasyonu izlendi(Şekil 4.2).

Şekil 4.2: Defekt bölgesinde kırık ucu altından başlayan yeni kemik yapımı (H&EX40).

4.1.1.4. 21 günlük kontrol grubu

Defekt bölgesinde aktif fibrosit, fibroblast ve genç mezenkim hücreleri arasında %70 alanda yeni kemik trabekülleri görüldü(Şekil 4.3).

Şekil 4.3: Kırık uçları arasıda defekt bölgesini büyük ölçüde kapatan köprü biçiminde yeni kemik yapımı (H&EX40).

4.1.1.5. 28 günlük kontrol grubu

Defekt bölgesinde, burayı kapatan, trabeküler yapıda yeni kemik dokusu saptanmaktaydı. Bunun altında aktif bağ dokusu içinde geniş alanlarda yeni kemik trabekülleri görülmekteydi(Şekil 4.4).

Şekil 4.4: Kırık uçlarından başlayan yoğun kemik yapımı (H&EX100).

4.1.1.6. 45 günlük kontrol grubu

Defekt bölgesinde trabeküler kemik köprüsü geniş alanlarda lameller kemiğe dönüşmüştü. İki olgu dışında ince fibröz doku altında doğal yapıda kemik iliği vardı(Şekil 4.5).

Şekil 4.5: Defekt bölgesini köprü biçiminde kapatan yeni kemik yapımı (H&EX40)

4.1.1.7. 60 günlük kontrol grubu

Defekt bölgesi lameller kemik dokusu ile kapanmıştı. Medüller alanda doğal yapıda kemik iliği saptanmaktaydı(Şekil 4.6).

Şekil 4.6: Defekt bölgesinde lameller biçim almış ve arada kemik iliği oluşmuş kemik köprüsü (H&EX100).

4.1.2 Karbokdioksit gazı grubu

4.1.2.1. 3 günlük karbokdioksit gazı grubu

Defekt bölgesinde taze kanama ve nekroz alanları arasında gevşek yapıda, damardan zengin bağ dokusu içinde yoğun lenfosit, plazmosit, az sayıda nötrofil polimorf içeren infiltrasyon saptandı. Çevrede nekrotik kemik parçacıkları görüldü.

4.1.2.2. 7 günlük karbokdioksit gazı grubu

Kırık fragmanları arasında damardan zengin, fibrosit ve fibroblastlardan oluşan doku içinde yaklaşık %20- 30’a varan alanlarda yeni kemik trabekülleri saptandı. Çevrede nekroz alanları ve orta derecede lenfosit, plazmosit infiltrasyonu vardı.

4.1.2.3.1.1.1. 14 günlük karbokdioksit gazı grubu

Fragmanlar arasında hafif derecede lenfosit, plazmosit, az sayıda nötrofil polimorf infiltrasyonu, fibroblast, fibrosit ve yoğun kollagen fibriller, yaklaşık

%40- 50’a varan alanlarda yeni kemik yapımı görülmekteydi(Şekil 4.7) .

Şekil 4.7: Defekt bölgesinde, fibröz doku altında, kırık uclarından başlayan yeni kemik trabekülleri (H&EX40).

4.1.2.4. 21 günlük karbokdioksit gazı grubu

Defekt bölgesinde lenfosit, plazmosit, nötrofil polimorf infiltrasyonu, aktif fibrosit, fibroblast ve genç mezenkim hücreleri, yoğun kollagen lifler görülmekteydi. Bir olguda defekt bölgesinde aktif bağ dokusu içinde kıkırdak adacıkları saptanmaktaydı. Bir olguda ise defekt alanında geniş nekroz ve abse odakları görülmekteydi(Şekil 4.8).

Şekil 4.8: Defekt bölgesinde nekrozun yerini alan fibröz kallus ve çevrede kondral kemikleşme alanı (H&EX100)

4.1.2.5. 28 günlük karbokdioksit gazı grubu

Defekt bölgesini kapatan ince, trabeküler kemik köprüsü oluşmuştu. Altındaki aktif bağ dokusu içinde yeni kemik trabekülleri görülmekteydi(Şekil 4.9).

Şekil 4.9: Defekt bölgesinde kırık uçlarından gelişen kemik yapımı ve ortada fibröz kallus. (H&EX40)

4.1.2.6. 45 günlük karbokdioksit gazı grubu

Defekt bölgesini beş olguda lameller kemik dokusu, diğerlerinde trabeküler kemik dokusu doldurmaktaydı. Bir olguda %60’a varan alanda fibröz doku varlığını sürdürmekteydi. Aynı olguda bu doku içinde iltihap hücresi infiltrasyonu saptanmaktaydı, diğerlerinde doğal yapıda kemik iliği izlendi(Şekil 4.10).

Şekil 4.10: Defekt bölgesini kapatma yönelik kemik köprüsü altında nekrotik kemik adacığı (H&EX40).

4.1.2.7. 60 günlük karbokdioksit gazı grubu

Defekt bölgesi lameller kemik dokusu ile kapanmıştı. Medüller alanda doğal yapıda kemik iliği saptanmaktaydı(Şekil 4.11).

Şekil 4.11: Defekt bölgesinde yüzeydeki fibrokartilaj doku altında defekti kapatan trabeküler kemik yapımı (H&EX40).

4.1.3 Sıvı nitrojen grubu

4.1.3.1 3 günlük sıvı nitrojen grubu

Defekt bölgesinde geniş nekroz alanları izlendi. Buralarda birkaç küçük alanda yoğun lenfosit, plazmosit ve nötrofil polimorf infiltrasyonu içeren granülasyon dokusu görüldü. Birkaç alanda mikroabse odakları saptandı(Şekil 4.12).

Şekil 4.12: Defekt bölgesinde nekroz alanları ve kemik iliği aralığında kanama alanları(H&EX40)

4.1.3.2. 7 günlük sıvı nitrojen grubu

Defekt bölgesinde geniş nekroz alanları arasında fibrosit ve fibroblastlardan oluşan damardan zengin bağ dokusu içinde %10- 20’lara varan alanlarda yeni kemik trabekülleri saptandı. Çevrede yoğun lenfosit, plazma hücresi, nötrofil polimorf infiltrasyonu izlendi. Birkaç alanda mikroabse odakları görüldü(Şekil 4.13).

Şekil 4-13: Defekt bölgesinde geniş koagülasyon nekrozu alanı (H&EX100).

4.1.3.3 14 günlük sıvı nitrojen grubu

Fragmanlar arasında yoğun lenfosit, plazmosit, nötrofil polimorf infiltrasyonu, geniş abse odakları ve nekroz alanları, fibrozis, %30- 50’ye varan alanda, bu alanı sınırlar tarzda yeni kemik yapımı izlenmekteydi(Şekil 4.14).

Şekil 4.14: Defekt bölgesi komşuluğunda medüller bölgede fibröz çeper ile sınırlı mikroabse odağı.(H&EX100).

4.1.3.4. 21 günlük sıvı nitrojen grubu

Olguların tümünde yoğun iltihapsal hücre infiltrasyonu, geniş nekroz alanları ve abse odakları saptanmaktaydı. Defekt bölgesini distal ve proksimalden sınırlar tarzda, medüller kanalı kapatan kemik oluşumları görülmekteydi(Şekil 4.15).

Şekil 4.15: Defekt alanı çevresinde nekroz bölgesini sınırlar tarzda kemik yapımı.H&EX100)

4.1.3.5. 28 günlük sıvı nitrojen grubu

Defekt bölgesinde görülen geniş nekroz alanları yerlerini aktif bağ dokusuna bırakmaktaydı. Bağ dokusu içinde yeni kemik trabekülleri izlenmekteydi(Şekil 4.16).

Şekil 4.16: Defekt bölgesinde nekrozun yerini alan, fibrin demetleri içeren gevşek yapıda bağ dokusu ve bu alan çevresinde bölgeyi sınırlayan yeni kemik yapımı (H&EX40)

4.1.3.6. 45 günlük sıvı nitrojen grubu

Defekt bölgesinde aktif bağ dokusu, kıkırdak adacıkları, nekroz odakları, yeni kemik trabekülleri görülmekteydi. Bu bölge distal ve proksimalden kalın trabeküler kemik dokusu ile sınırlanmaktaydı(Şekil 4.17).

Şekil 4.17: Defekt bölgesini dolduran gevşek yapıda bağ dokusu çevresinde yeni kemik yapımı (H&EX100).

4.1.3.7. 60 günlük sıvı nitrojen grubu

Defekt bölgesinde fibröz doku içinde yeni kemik trabekülleri saptanmaktaydı. Bir olguda bu trabeküller köprü oluşturmaktaydı. Bu olgu dışındaki tüm olgularda nekroz alanları, iltihapsal hücre infiltrasyonu içeren bağ dokusu ile defekt alanı dolmuştu. Defekt alanı distal ve proksimalde yeni kemik dokusu ile sınırlanmıştı(Şekil 4.18)

Şekil 4.18: Defekt bölgesi büyük ölçüde dolduran kemik trabekülleri arasında varlığını sürdüren kıkırdak adacığı. (H&EX40).

4.2 İstatistiksel bulgular

Yeni Kemik Yapımı CO2 Grubu

Nitrojen Grubu

Kontrol Grubu

	%0 - %5	6	66,7%	9	100,0%	6	66,7%	χ²:3,86
3.Gün	%5 - %30	3	33,3%	0	0,0%	3	33,3%	p=0,145
	%0 - %5	0	0,0%	2	22,2%	0	0,0%
	%5 - %30	6	66,7%	5	55,6%	4	44,4%	χ²:5,8
7.Gün	%30 - %60	3	33,3%	2	22,2%	5	55,6%	p=0,215
	%5 - %30	0	0,0%	2	22,2%	0	0,0%
	%30 - %60	5	55,6%	6	66,7%	7	77,8%	χ²:6,33
14.Gün	> %60	4	44,4%	1	11,1%	2	22,2%	p=0,176
	%0 - %5	0	0,0%	1	11,1%	0	0,0%
	%5 - %30	1	11,1%	1	11,1%	0	0,0%
	%30 - %60	4	44,4%	6	66,7%	7	77,8%	χ²:5,82
21.Gün	> %60	4	44,4%	1	11,1%	2	22,2%	p=0,443
	%5 - %30	0	0,0%	1	11,1%	0	0,0%
	%30 - %60	0	0,0%	8	88,9%	0	0,0%	χ²:27
28.Gün	> %60	9	100,0%	0	0,0%	9	100,0%	p=0,0001
	%30 - %60	1	11,1%	8	88,9%	0	0,0%	χ²:19
45.Gün	> %60	8	88,9%	1	11,1%	9	100,0%	p=0,0001
	%30 - %60	6	66,7%	7	77,8%	0	0,0%	χ²:12,76
60.Gün	> %60	3	33,3%	2	22,2%	9	100,0%	p=0,002

Tablo 4.1: Yeni kemik yapımının gruplara ve günlere göre istatistiksel karşılaştırılması

	28.Gün	45.Gün	60. Gün
CO2 / Nitrojen	0,0001	0,003	0,998
CO2 / Kontrol		0,998	0,009
Nitrojen / Kontrol	0,0001	0,0004	0,002

Tablo 4.2: Yeni kemik yapımının gruplar içinde karşılaştırılması

	CO2	N	Kontrol
3.Gün / 7.Gün	0,007	0,003	0,004
3.Gün / 14.Gün	0,008	0,0001	0,0001
3.Gün / 21.Gün	0,002	0,002	0,0001
3.Gün / 28.Gün	0,0001	0,0001	0,0001
3.Gün / 45.Gün	0,0001	0,0001	0,0001
3.Gün / 60.Gün	0,0001	0,0001	0,0001
7.Gün / 14.Gün	0,005	0,09	0,042
7.Gün / 21.Gün	0,021	0,112	0,042
7.Gün / 28.Gün	0,0001	0,016	0,0001
7.Gün / 45.Gün	0,001	0,009	0,0001
7.Gün / 60.Gün	0,007	0,008	0,0001
14.Gün / 21.Gün	0,574	0,721	0,998
14.Gün / 28.Gün	0,009	0,445	0,001
14.Gün / 45.Gün	0,04	0,319	0,001
14.Gün / 60.Gün	0,772	0,3	0,001
21.Gün / 28.Gün	0,031	0,515	0,001
21.Gün / 45.Gün	0,127	0,515	0,001
21.Gün / 60.Gün	0,462	0,492	0,001
28.Gün / 45.Gün	0,303	0,318
28.Gün / 60.Gün	0,003	0,216
45.Gün / 60.Gün	0,016	0,527

Tablo 4.3 : Yeni kemik yapımının gruplar içinde günlere göre karşılaştırılması

Yeni Kemik Oluşumu

100%

90%

80%

70%

60%

50%

40%

30%

20%

10%

0%

3.Gün

7.Gün

14.Gün

21.Gün

28.Gün 45.Gün 60.Gün

CO2 Grubu Nitrojen Grubu Kontrol Grubu

%0-%5

%5 -%30

%0-%5

%5 -%30

%30-%60

%5 - %30

%30-%60

>%60

%0-%5

%5 -%30

%30-%60

>%60

%0-%5

%5 -%30

>%60

%30-%60

> %60

%30-%60

>%60

Tablo 4.4: Yemi kemik yapımının gruplara ve günlere gore dağılımının grafik olarak karşılaştırılmaları

Fibrozis CO2 Grubu

Nitrojen Grubu

Kontrol Grubu

	%0 - %5	0	0,0%	3	33,3%	2	22,2%	χ²:5,94
	%5 - %30	9	100,0%	5	55,6%	7	77,8%	p=0,203
3.Gün	%30 - %60	0	0,0%	1	11,1%	0	0,0%
	%5 - %30	1	11,1%	1	11,1%	0	0,0%
	%30 - %60	6	66,7%	6	66,7%	9	100,0%	χ²:3,86
7.Gün	> %60	2	22,2%	2	22,2%	0	0,0%	p=0,426
	%0 - %5	1	11,1%	0	0,0%	0	0,0%
	%5 - %30	4	44,4%	0	0,0%	0	0,0%
	%30 - %60	3	33,3%	7	77,8%	9	100,0%	χ²:14,95
14.Gün	> %60	1	11,1%	2	22,2%	0	0,0%	p=0,021
	%5 - %30	2	22,2%	0	0,0%	0	0,0%
	%30 - %60	3	33,3%	6	66,7%	6	66,7%	χ²:5,4
21.Gün	> %60	4	44,4%	3	33,3%	3	33,3%	p=0,249
	%0 - %5	2	22,2%	0	0,0%	5	55,6%
	%5 - %30	6	66,7%	0	0,0%	3	33,3%
	%30 - %60	1	11,1%	4	44,4%	1	11,1%	χ²:24,43
28.Gün	> %60	0	0,0%	5	55,6%	0	0,0%	p=0,0001
	%0 - %5	6	66,7%	0	0,0%	9	100,0%
	%5 - %30	1	11,1%	0	0,0%	0	0,0%
	%30 - %60	0	0,0%	6	66,7%	0	0,0%	χ²:25,2
45.Gün	> %60	2	22,2%	3	33,3%	0	0,0%	p=0,0001
	%0 - %5	0	0,0%	1	11,1%	9	100,0%
	%5 - %30	1	11,1%	0	0,0%	0	0,0%
	%30 - %60	1	11,1%	1	11,1%	0	0,0%	χ²:24,6
60.Gün	> %60	7	77,8%	7	77,8%	0	0,0%	p=0,0001

Tablo 4.5: Fibrozisin gruplara ve günlere göre istatistiksel karşılaştırılması

	14.Gün	28.Gün	45.Gün	60. Gün
CO2 / Nitrojen	0,07	0,002	0,004	0,532
CO2 / Kontrol	0,02	0,318	0,105	0,0004
Nitrojen / Kontrol	0,131	0,002	0,0001	0,0007

Tablo 4.6: Fibrozisin gruplar içinde karşılaştırılması

	CO2	N	Kontrol
3.Gün / 7.Gün	0,001	0,011	0,0001
3.Gün / 14.Gün	0,07	0,002	0,0001
3.Gün / 21.Gün	0,003	0,002	0,0001
3.Gün / 28.Gün	0,165	0,002	0,143
3.Gün / 45.Gün	0,001	0,002	0,001
3.Gün / 60.Gün	0,001	0,005	0,001
7.Gün / 14.Gün	0,247	0,584
7.Gün / 21.Gün	0,368	0,549	0,058
7.Gün / 28.Gün	0,011	0,261	0,001
7.Gün / 45.Gün	0,007	0,549	0,0001
7.Gün / 60.Gün	0,04	0,039	0,0001
14.Gün / 21.Gün	0,325	0,599	0,058
14.Gün / 28.Gün	0,425	0,147	0,001
14.Gün / 45.Gün	0,03	0,599	0,0001
14.Gün / 60.Gün	0,06	0,016	0,0001
21.Gün / 28.Gün	0,029	0,343	0,002
21.Gün / 45.Gün	0,019	0,998	0,0001
21.Gün / 60.Gün	0,341	0,046	0,0001
28.Gün / 45.Gün	0,036	0,343	0,07
28.Gün / 60.Gün	0,006	0,209	0,07
45.Gün / 60.Gün	0,021	0,046

Tablo 4.7: Fibrozisin gruplar içinde günlere gore karşılaştırılması

Fibrozis

100%

90%

80%

70%

60%

50%

40%

30%

20%

10%

0%

3.Gün 7.Gün

14.Gün

21.Gün

28.Gün

45.Gün

60.Gün

CO2 Grubu Nitrojen Grubu Kontrol Grubu

%0 - %5

%5 - %30

%30 - %60

%5 - %30

%30 - %60

> %60

%0 - %5

%5 - %30

%30 - %60

> %60

%5 - %30

%30 - %60

> %60

%0 - %5

%5 - %30

%30 - %60

> %60

%0 - %5

%5 - %30

%30 - %60

> %60

%0 - %5

%5 - %30

%30 - %60

> %60

Tablo 4.8: Fibrozisin gruplara ve günlere gore dağılımının grafik olarak karşılaştırılmaları

Nekroz CO2 Grubu

Nitrojen Grubu

Kontrol Grubu

	%5 - %30	1	11,1%	0	0,0%	5	55,6%
	%30 - %60	8	88,9%	0	0,0%	4	44,4%	χ²:33
3.Gün	> %60	0	0,0%	9	100,0%	0	0,0%	p=0,0001
	%0 - %5	0	0,0%	0	0,0%	4	44,4%
	%5 - %30	5	55,6%	0	0,0%	5	55,6%
	%30 - %60	3	33,3%	0	0,0%	0	0,0%	χ²:33,6
7.Gün	> %60	1	11,1%	9	100,0%	0	0,0%	p=0,0001
	%0 - %5	0	0,0%	0	0,0%	4	44,4%
	%5 - %30	5	55,6%	0	0,0%	5	55,6%
	%30 - %60	4	44,4%	1	11,1%	0	0,0%	χ²:34,2
14.Gün	> %60	0	0,0%	8	88,9%	0	0,0%	p=0,0001
	%0 - %5	2	22,2%	0	0,0%	6	66,7%
	%5 - %30	4	44,4%	0	0,0%	3	33,3%
	%30 - %60	2	22,2%	2	22,2%	0	0,0%	χ²:23,46
21.Gün	> %60	1	11,1%	7	77,8%	0	0,0%	p=0,001
	%0 - %5	4	44,4%	0	0,0%	9	100,0%
	%5 - %30	4	44,4%	3	33,3%	0	0,0%	χ²:21,96
28.Gün	%30 - %60	1	11,1%	6	66,7%	0	0,0%	p=0,0001
	%0 - %5	8	88,9%	2	22,2%	9	100,0%
	%5 - %30	1	11,1%	4	44,4%	0	0,0%	χ²:15,73
45.Gün	> %60	0	0,0%	3	33,3%	0	0,0%	p=0,003
	%0 - %5	7	77,8%	2	22,2%	9	100,0%
	%5 - %30	1	11,1%	4	44,4%	0	0,0%
	%30 - %60	0	0,0%	3	33,3%	0	0,0%	χ²:17,53
60.Gün	> %60	1	11,1%	0	0,0%	0	0,0%	p=0,008

Tablo 4.9: Nekrozun gruplara ve günlere göre istatistiksel karşılaştırılması

	3.Gün	7.Gün	14.Gün	21.Gün	28.Gün	45.Gün	60. Gün
CO2 / Nitrojen	0,0001	0,0007	0,0006	0,014	0,021	0,015	0,035
CO2 / Kontrol	0,04	0,04	0,018	0,161	0,031	0,3	0,324
Nitrojen / Kontrol	0,0001	0,0001	0,0004	0,0004	0,0001	0,003	0,003

Tablo 4.10: Nekrozun gruplar içinde karşılaştırılması

	CO2	N	Kontrol
3.Gün / 7.Gün	0,051		0,018
3.Gün / 14.Gün	0,046	0,3	0,018
3.Gün / 21.Gün	0,038	0,134	0,005
3.Gün / 28.Gün	0,004	0,0001	0,0001
3.Gün / 45.Gün	0,0001	0,0001	0,0001
3.Gün / 60.Gün	0,001	0,0001	0,0001
7.Gün / 14.Gün	0,565	0,303	0,998
7.Gün / 21.Gün	0,51	0,134	0,343
7.Gün / 28.Gün	0,106	0,0001	0,009
7.Gün / 45.Gün	0,002	0,011	0,009
7.Gün / 60.Gün	0,005	0,0001	0,009
14.Gün / 21.Gün	0,286	0,527	0,343
14.Gün / 28.Gün	0,052	0,001	0,009
14.Gün / 45.Gün	0,001	0,026	0,009
14.Gün / 60.Gün	0,003	0,002	0,009
21.Gün / 28.Gün	0,572	0,002	0,058
21.Gün / 45.Gün	0,038	0,022	0,058
21.Gün / 60.Gün	0,08	0,004	0,058
28.Gün / 45.Gün	0,127	0,011
28.Gün / 60.Gün	0,202	0,208
45.Gün / 60.Gün	0,587	0,112

Tablo 4.11: Nekrozun gruplar içinde günlere gore karşılaştırılması

Nekroz

100%

90%

80%

70%

60%

50%

40%

30%

20%

10%

0%

3.Gün

7.Gün

14.Gün

21.Gün

28.Gün 45.Gün

60.Gün

CO2 Grubu Nitrojen Grubu Kontrol Grubu

%5 - %30

%30 - %60

> %60

%0 - %5

%5 - %30

%30 - %60

> %60

%0 - %5

%5 - %30

%30 - %60

> %60

%0 - %5

%5 - %30

%30 - %60

> %60

%0 - %5

%5 - %30

%30 - %60

%0 - %5

%5 - %30

> %60

%0 - %5

%5 - %30

%30 - %60

> %60

Tablo 4.12: Nekrozun gruplara ve günlere gore dağılımının grafik olarak karşılaştırılmaları

İltihap CO2 Grubu

Nitrojen Grubu

Kontrol Grubu

	%5 - %30	0	0,0%	5	55,6%	4	44,4%
	%30 - %60	9	100,0%	1	11,1%	5	55,6%	χ²:17,07
3.Gün	> %60	0	0,0%	3	33,3%	0	0,0%	p=0,002
	%0 - %5	1	11,1%	1	11,1%	0	0,0%
	%5 - %30	1	11,1%	7	77,8%	6	66,7%	χ²:10,52
7.Gün	%30 - %60	7	77,8%	1	11,1%	3	33,3%	p=0,033
	%5 - %30	7	77,8%	0	0,0%	8	88,9%
	%30 - %60	1	11,1%	3	33,3%	1	11,1%	χ²:18,06
14.Gün	> %60	1	11,1%	6	66,7%	0	0,0%	p=0,001
	%0 - %5	1	11,1%	0	0,0%	6	66,7%
	%5 - %30	4	44,4%	0	0,0%	2	22,2%
	%30 - %60	2	22,2%	1	11,1%	1	11,1%	χ²:23,76
21.Gün	> %60	2	22,2%	8	88,9%	0	0,0%	p=0,001
	%0 - %5	9	100,0%		0,0%	8	88,9%
	%5 - %30	0	0,0%	2	22,2%	1	11,1%
	%30 - %60	0	0,0%	6	66,7%	0	0,0%	χ²:24,59
28.Gün	> %60	0	0,0%	1	11,1%	0	0,0%	p=0,0001
	%0 - %5	7	77,8%	1	11,1%	9	100,0%
	%5 - %30	0	0,0%	5	55,6%	0	0,0%
	%30 - %60	2	22,2%		0,0%	0	0,0%	χ²:26,12
45.Gün	> %60	0	0,0%	3	33,3%	0	0,0%	p=0,0001
	%0 - %5	1	11,1%	1	11,1%	9	100,0%
	%5 - %30	6	66,7%	6	66,7%	0	0,0%
	%30 - %60	1	11,1%	2	22,2%	0	0,0%	χ²:21,64
60.Gün	> %60	1	11,1%		0,0%	0	0,0%	p=0,001

Tablo 4.13: İltihabın gruplara ve günlere göre istatistiksel karşılaştırılması

	3.Gün	7.Gün	14.Gün	21.Gün	28.Gün	45.Gün	60. Gün
CO2 / Nitrojen	0,0007	0,011	0,003	0,03	0,0004	0,0023	0,721
CO2 / Kontrol	0,02	0,04	0,586	0,08	0,303	0,13	0,0024
Nitrojen / Kontrol	0,055	0,354	0,0006	0,001	0,0016	0,0007	0,0007

Tablo 4.14: İltihabın gruplar içinde karşılaştırılması

	CO2	N	Kontrol
3.Gün / 7.Gün	0,325	0,228	0,343
3.Gün / 14.Gün	0,001	0,03	0,046
3.Gün / 21.Gün	0,01	0,026	0,009
3.Gün / 28.Gün	0,0001	0,053	0,001
3.Gün / 45.Gün	0,001	0,572	0,0001
3.Gün / 60.Gün	0,002	0,219	0,0001
7.Gün / 14.Gün	0,012	0,002	0,257
7.Gün / 21.Gün	0,08	0,001	0,011
7.Gün / 28.Gün	0,001	0,039	0,001
7.Gün / 45.Gün	0,016	0,288	0,0001
7.Gün / 60.Gün	0,02	0,815	0,0001
14.Gün / 21.Gün	0,478	0,257	0,008
14.Gün / 28.Gün	0,0001	0,037	0,001
14.Gün / 45.Gün	0,002	0,019	0,0001
14.Gün / 60.Gün	0,734	0,004	0,0001
21.Gün / 28.Gün	0,002	0,004	0,445
21.Gün / 45.Gün	0,015	0,026	0,0165
21.Gün / 60.Gün	0,785	0,002	0,165
28.Gün / 45.Gün	0,134	0,026	0,303
28.Gün / 60.Gün	0,002	0,112	0,303
45.Gün / 60.Gün	0,008	0,165

Tablo 4.15 : İltihabın gruplar içinde günlere gore karşılaştırılması

İltihap

100%

90%

80%

70%

60%

50%

40%

30%

20%

10%

0%

3.Gün 7.Gün 14.Gün

21.Gün

28.Gün

45.Gün

60.Gün

CO2 Grubu Nitrojen Grubu Kontrol Grubu

%5 - %30

%30 - %60

> %60

%0 - %5

%5 - %30

%30 - %60

%5 - %30

%30 - %60

> %60

%0 - %5

%5 - %30

%30 - %60

> %60

%0 - %5

%5 - %30

%30 - %60

> %60

%0 - %5

%5 - %30

%30 - %60

> %60

%0 - %5

%5 - %30

%30 - %60

> %60

Tablo 4.16: İltihabın gruplara ve günlere gore dağılımının grafik olarak karşılaştırılmaları

Kırık CO2 Grubu

Nitrojen Grubu

Kontrol Grubu

3.Gün	yok	9	100,0%	9	100,0%	9	100,0%
7.Gün	yok	9	100,0%	9	100,0%	9	100,0%
	var	0	0,0%	1	11,1%	0	0,0%	χ²:2,08
14.Gün	yok	9	100,0%	8	88,9%	9	100,0%	p=0,354
	var	0	0,0%	2	22,2%	0	0,0%	χ²:4,32
21.Gün	yok	9	100,0%	7	77,8%	9	100,0%	p=0,115
	var	0	0,0%	2	22,2%	0	0,0%	χ²:4,32
28.Gün	yok	9	100,0%	7	77,8%	9	100,0%	p=0,115
	var	1	11,1%		0,0%	0	0,0%	χ²:2,08
45.Gün	yok	8	88,9%	9	100,0%	9	100,0%	p=0,354
60.Gün	yok	9	100,0%	9	100,0%	9	100,0%

Tablo 4.17: Gruplara göre kırık dağılımının istatistiksel değerlendirilmesi

Primer

Kapanma CO2 Grubu

Nitrojen Grubu

Kontrol Grubu

	var	9	100,0%	7	77,8%	8	88,9%	χ²:2,25
3.Gün	yok	0	0,0%	2	22,2%	1	11,1%	p=0,325
	var	9	100,0%	8	88,9%	8	88,9%	χ²:1,08
7.Gün	yok	0	0,0%	1	11,1%	1	11,1%	p=0,583
	var	9	100,0%	5	55,6%	8	88,9%	χ²:6,38
14.Gün	yok	0	0,0%	4	44,4%	1	11,1%	p=0,041
	var	7	77,8%	5	55,6%	9	100,0%	χ²:5,14
21.Gün	yok	2	22,2%	4	44,4%	0	0,0%	p=0,076
	var	9	100,0%	8	88,9%	9	100,0%	χ²:2,08
28.Gün	yok	0	0,0%	1	11,1%	0	0,0%	p=0,354
	var	9	100,0%	8	88,9%	9	100,0%	χ²:2,08
45.Gün	yok	0	0,0%	1	11,1%	0	0,0%	p=0,354
	var	8	88,9%	9	100,0%	9	100,0%	χ²:2,08
60.Gün	yok	1	11,1%	0	0,0%	0	0,0%	p=0,354

Tablo 4.18: Gruplara göre primer yara kapanmasının dağılımının istatistiksel değerlendirilmesi

4.3 İstatistiksel bulguların değerlendirilmesi

CO2, nitrojen ve kontrol gruplarının 3.gün yeni kemik oluşumu dağılımları arasında istatistiksel farklılık gözlenmemiştir (p=0,145).

CO2 ,nitrojen ve kontrol gruplarının 7.gün yeni kemik oluşumu dağılımları arasında istatistiksel farklılık gözlenmemiştir (p=0,215).

CO2, nitrojen ve kontrol gruplarının 14.gün yeni kemik oluşumu dağılımları arasında istatistiksel farklılık gözlenmemiştir (p=0,176).

CO2, nitrojen ve kontrol gruplarının 21.gün yeni kemik oluşumu dağılımları arasında istatistiksel farklılık gözlenmemiştir (p=0,443).

CO2, nitrojen ve kontrol gruplarının 28.gün yeni kemik oluşumu dağılımları arasında istatistiksel farklılık gözlenmiştir (p=0,0001). CO2 grubunda yeni kemik oluşumunun deneklerin tümünde >%60 düzeyinde olduğu, nitrojen grubunda ise

%88,9’unun %30 - %60 düzeyinde olduğu gözlenmiş, bu dağılımın istatistiksel olarak anlamlı olduğu bulunmuştur (p=0,0001). Nitrojen grubunun yeni kemik oluşumunun deneklerin %88,9’unda %30 - %60 düzeyinde olduğu, kontrol grubunun ise tümünün

> %60 düzeyinde olduğu gözlenmiş, bu dağılımın istatistiksel olarak anlamlı olduğu bulunmuştur (p=0,0001). CO2 ve kontrol grubunun yeni kemik yapımı dağılımı aynı bulunmuştur.

CO2, nitrojen ve kontrol gruplarının 45.gün yeni kemik oluşumu dağılımları arasında istatistiksel farklılık gözlenmiştir (p=0,0001). CO2 grubunun yeni kemik oluşumunun deneklerin %88,9’unda >%60 düzeyinde olduğu, nitrojen grubunda ise

%88,9’unun %30 - %60 düzeyinde olduğu gözlenmiş, bu dağılımın istatistiksel olarak anlamlı olduğu bulunmuştur (p=0,003). Nitrojen grubunda yeni kemik oluşumunun deneklerin %11,1’inde >%60 düzeyinde olduğu, kontrol grubunda ise tümünün >%60 düzeyinde olduğu gözlenmiş, bu dağılımın istatistiksel olarak anlamlı olduğu bulunmuştur (p=0,0004).

CO2, nitrojen ve kontrol gruplarının 60.gün yeni kemik oluşumu dağılımları arasında istatistiksel farklılık gözlenmiştir (p=0,002). CO2 grubunun yeni kemik oluşumunun deneklerin %66,7’sinde %30 - %60 düzeyinde olduğu, kontrol grubunda ise tümünün > %60 düzeyinde olduğu gözlenmiş, bu dağılımın istatistiksel olarak anlamlı olduğu bulunmuştur (p=0,009). Nitrojen grubunda yeni kemik oluşumunun deneklerin %22,2’sinde > %60 düzeyinde olduğu, kontrol grubunun ise tümünün >

%60 düzeyinde olduğu gözlenmiş ve bu dağılımın istatistiksel olarak anlamlı olduğu bulunmuştur (p=0,002).

Karbondioksit grubunda deneklerin yeni kemik yapımı dağılımında 3. gün ile 7. günler arasında(p=0,007), 3. gün ile 14. günler arasında(p=0,008), 3.gün ile 21.xxxxxx arasında(p=0,002), 3.gün ile 28.günler arasında(p=0,0001), 3.gün ile 45.günler arasında(p=0,0001), 3.gün ile 60. gün arasında(p=0,0001), 7.xxx ile 14.xxxxxx arasında(p=0,005), 7.gün ile 21.xxxxxx arasında (p=0,021), 7.gün ile 28.xxxxxx arasında(p=0,0001) ve 7.xxx ile 45.xxxxxx arasında(p=0,001), 7.gün ile 60.xxxxxx arasında(p=0,007), 14.xxx ile 28.günler arasında(p=0,009), 14.gün ile 45.xxxxxx arasında(p=0,04),21.gün ile 28.xxxxxx arasında(p=0,031), 28.gün ve 60.günler arasında(p=0,003) ve 45.gün ile 60.xxxxxx arasında(p=0,016) istatistiksel olarak anlamlılık bulunurken, 14.gün ile 21.günler arasında(p=0,574), 14.gün ile 60.xxxxxx arasında(p=0,772), 21.gün ile 45.xxxxxx arasında(p=0,127), 21.gün ile 60.xxxxxx arasında(p=0,462) ve 28.gün ile 45.xxxxxx arasında(p=0,303) istatistiksel olarak anlamlılık bulunmamıştır.

Nitrojen grubunda deneklerin yeni kemik yapımı dağılımında 3. gün ile 7. günler arasında(p=0,003), 3. gün ile 14. günler arasında(p=0,0001), 3.gün ile 21.xxxxxx arasında(p=0,002), 3.gün ile 28.xxxxxx arasında(p=0,0001), 3.gün ile 45.günler arasında(p=0,0001), 3.gün ile 60. gün arasında(p=0,0001), 7.xxx ile 28.xxxxxx arasında(p=0,016), 7.gün ile 45.xxxxxx arasında (p=0,009) ve 7.gün ile 60.günler arasında(p=0,008) istatistiksel olarak anlamlılık bulunurken, 7.gün ile 14.xxxxxx arasında(p=0,09), 7.gün ile 21.xxxxxx arasında(p=0,112), 14. gün ile 21.xxxxxx arasında(p=0,772), 14.gün ile 28.xxxxxx arasında(p=0,445), 14.gün ile 45.xxxxxx arasında(p=0,319), 14.gün ile 60.xxxxxx arasında(p=0,3), 21.xxx ile 28.xxxxxx arasında(p=0,515), 21.gün ile 45.xxxxxx arasında(p=0,515), 21.xxx ile 60.xxxxxx arasında(p=0,492), 28.gün ile 45.xxxxxx arasında(p=0,318), 28.gün ve 60.xxxxxx arasında(p=0,216) ve 45.gün ile 60.xxxxxx arasında(p=0,527) istatistiksel olarak anlamlılık bulunmamıştır.

Kontrol grubunda deneklerin yeni kemik yapımı dağılımında 3. gün ile 7. günler arasında(p=0,004), 3. gün ile 14. günler arasında(p=0,0001), 3.gün ile 21.xxxxxx arasında(p=0,0001), 3.gün ile 28.xxxxxx arasında(p=0,0001), 3.gün ile 45.günler arasında(p=0,0001), 3.gün ile 60. gün arasında(p=0,0001), 7.xxx ile 14.xxxxxx arasında(p=0,042), 7.gün ile 21.xxxxxx arasında (p=0,042), 7.gün ile 28.xxxxxx